游 艷, 周 春, 李翠限, 李 東, 邵薇薇, 彭 錦, 李婉貞, 劉培慶, 沈曉燕,2

(1. 中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實驗室，廣東 廣州 510006；2.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海 201203)

隱丹參酮對骨髓來源巨噬細(xì)胞功能的影響

游 艷1, 周 春1, 李翠限1, 李 東1, 邵薇薇1, 彭 錦1, 李婉貞1, 劉培慶1, 沈曉燕1,2

(1. 中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實驗室，廣東 廣州 510006；2.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海 201203)

目的 研究隱丹參酮對骨髓巨噬細(xì)胞功能的影響。方法 激光共聚焦檢測巨噬細(xì)胞吞噬功能；慶大霉素保護(hù)法檢測巨噬細(xì)胞殺菌能力；q-PCR法檢測TNF-α、IL-6、IL-10的表達(dá)水平；Western blot檢測NF-κB通路；LPS(lipopolysaccharides)及IL-4刺激檢測巨噬細(xì)胞分型。結(jié)果 隱丹參酮能夠增強巨噬細(xì)胞吞噬功能及殺菌能力；促進(jìn)抗炎因子IL-10并抑制促炎因子TNF-α及IL-6的表達(dá)；阻斷NF-κB信號通路；誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型分化。結(jié)論 隱丹參酮能促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型分化，并上調(diào)骨髓巨噬細(xì)胞的免疫功能。

隱丹參酮；巨噬細(xì)胞；吞噬；殺菌；TNF-α；分化

中藥丹參是唇形科鼠尾草植物丹參(salviamiltiorrhizabunge)的干燥根及根莖，有活血化瘀的功效，臨床上用于治療心血管疾病，如冠心病、缺血性腦血管疾病等。隱丹參酮[(R)-1, 2, 6, 7, 8, 9-Hexahydro-1, 6, 6-trimethyl-phenanthro (1,2-b)furan-10, 11-dione, cryptotanshinone, CTS]是中藥丹參的脂溶性成分之一，屬二萜醌類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤活性[1-2]。Tang等[3]發(fā)現(xiàn)CTS可抑制ERK1/2、p38MAPK等MAPKs，這部分解釋了CTS發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制。眾所周知，巨噬細(xì)胞是機(jī)體不可或缺的抗原呈遞細(xì)胞，通過吞噬病原微生物、呈遞抗原及產(chǎn)生多種細(xì)胞因子參與機(jī)體免疫應(yīng)答。巨噬細(xì)胞按照極化類型可統(tǒng)分為兩種，M1型和M2型。機(jī)體免疫功能多樣性的需要導(dǎo)致了巨噬細(xì)胞極化分型的產(chǎn)生，M1 / M2型比例的改變，可反映局部組織的微環(huán)境炎癥狀態(tài)。

本研究擬通過測定骨髓來源巨噬細(xì)胞功能相關(guān)指標(biāo)，即：吞噬能力、殺菌能力及分泌TNF-α、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子能力，研究CTS對巨噬細(xì)胞功能的影響，并在巨噬細(xì)胞極化的兩種條件下，研究CTS對巨噬細(xì)胞分型的影響，以期進(jìn)一步解釋CTS發(fā)揮抗菌消炎作用的具體機(jī)制，為治療多種免疫疾病提供新的治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與試劑 CTS、熒光微球及LPS購自美國Sigma-Aldrich公司；人源重組巨噬細(xì)胞集落刺激因子M-CSF、IL-4購自Peprotech公司；DMEM、胎牛血清、抗生素購自Gibco公司；TRIzol、引物購自于Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒購自TaKaRa公司，抗體p65、GAPDH、β-actin、IκB購自CST公司。FVB純系小鼠， 8～10周， 體質(zhì)量22～25 g，購自中山大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 儀器 雙人單面超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Electron)；PL303型電子天平(Mettler Toledo)；激光共聚焦系統(tǒng)(Zeiss 710，ZEISS)；定量PCR儀(BIORAD)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓巨噬細(xì)胞的制備與培養(yǎng) 將小鼠頸椎脫臼處死，于75%酒精中浸泡3～5 min，剪下股骨，剝離肌肉，用1ml注射器將骨髓沖出，過篩，1 000×g離心5 min，棄上清，臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞>0.95，用含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108個cell·L-1，并加入10-5mg·L-1M-CSF，種板，于5%CO2，37℃孵箱中培養(yǎng)7 d，每2天換1次液。

1.2.2 吞噬實驗 接種細(xì)胞于含有玻片的小皿中，分3組，M-CSF刺激7 d后，無血清培養(yǎng)12 h，根據(jù)文獻(xiàn)[4]，采用10 μmol·L-1CTS預(yù)處理后3或6 h，預(yù)冷的PBS洗滌3次，根據(jù)使用說明加入熒光微球，于冰上放置5 min后，置于37℃孵箱孵育30 min，激光共聚焦系統(tǒng)拍照。

1.2.3 慶大霉素保護(hù)實驗 接種細(xì)胞于12孔板，分兩組，即control組及CTS組，每組3個復(fù)孔。 CTS處理6 h后，參照Laroux FS[5]法進(jìn)行。步驟如下：細(xì)菌與細(xì)胞按10 ∶1比率于37℃共同孵育1 h；棄去培養(yǎng)液，用100 mg·L-1慶大霉素作用1 h，清除胞外細(xì)菌；隨后，改用10 mg·L-1慶大霉素37℃分別孵育2、6、24 h，于相應(yīng)時間點，收集細(xì)胞裂解液。即：PBS洗滌細(xì)胞3次，用0.5%的Triton X-100室溫裂解15 min，用無菌PBS稀釋不同倍數(shù)，涂皿，37℃倒置24 h，計數(shù)菌落數(shù)。

1.2.4 TNF-α、IL-6，IL-10的測定方法 采用實時定量PCR(real time PCR)。接種細(xì)胞于6孔板，于d 8用10 μmol·L-1CTS分別處理3和6 h后，加入1 mg·L-1LPS刺激15 min，提細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT-PCR。具體操作方法按照TaKaRa試劑盒說明書進(jìn)行。Real Time PCR反應(yīng)體系為：RNase Free dH2O 8.5 μl；上下游引物各1 μl；SYBY Premix Ex Taq II 12.5 μl；cDNA模板2 μl。反應(yīng)程序：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s，60 ℃，30 s(40個循環(huán))。

1.2.5 Western blot檢測細(xì)胞蛋白變化 按照1.2.4種細(xì)胞于6孔板，采用不同劑量的CTS作用6 h，給予1 mg·L-1LPS刺激15 min后，用預(yù)冷PBS洗滌2次，提核蛋白和總蛋白，分別用Bradford法和BCA法定量。分裝蛋白，SDS-PAGE電泳。5 %脫脂牛奶室溫封閉1 h，4℃孵育一抗過夜。d 2回收一抗，TBST洗3次，每次5 min。室溫孵育二抗(1 ∶10 000)1 h，TBST洗3次，顯影。顯影結(jié)果采用Quantity One軟件進(jìn)行半定量分析。

1.2.6 巨噬細(xì)胞分型檢測 采用實時定量PCR。接種細(xì)胞于6孔板，于d 8用10 μmol·L-1CTS預(yù)處理6 h后，在兩種不同的極化條件下[6]，即：LPS(1 mg·L-1)作用3 h或IL- 4(10-5mg·L-1)作用24 h，提細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT-PCR，檢測巨噬細(xì)胞各分型marker的表達(dá)情況，具體操作方法參見1.2.4。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。兩兩比較用q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 CTS對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響吞噬識別是巨噬細(xì)胞發(fā)揮功能的前提，本研究首先檢測CTS對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。由Fig 1可見，在有CTS作用下，小鼠骨髓巨噬細(xì)胞吞噬功能有上調(diào)趨勢。經(jīng)10 μmol·L-1CTS處理后，與對照組相比，巨噬細(xì)胞的吞噬功能增強，即單個細(xì)胞吞噬的熒光微球增多。說明CTS可促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬外源異物。

Fig 1 Effect of CTS on the phagocytosis of bio-particles

For fluorescence microscopic observation of phagocytosis, bone marrow macrophages were seeded at 2×105cells/well in 8-well Lab-Tek chamber glass slides and incubated over night in complete medium. The wells were washed with phosphate-buffered saline (PBS), fluorescent particles were added and the slides were observed using fluorescence microscopy at the indicated times. Experiments showed that numbers of particles phagocytosed by single cell were increased in the presence of CTS.

2.2 CTS對巨噬細(xì)胞殺菌能力的影響已證實CTS可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬異物，進(jìn)一步研究CTS對巨噬細(xì)胞清除胞內(nèi)異物能力的影響。由Fig 2可知，10 μmol·L-1CTS預(yù)處理6 h，可明顯增強巨噬細(xì)胞殺菌功能，差異有顯著性。

2.3 CTS對小鼠骨髓巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6、IL-10的影響巨噬細(xì)胞的重要功能之一是分泌細(xì)胞因子，本研究進(jìn)一步檢測了主要由巨噬細(xì)胞分泌的幾種細(xì)胞因子。由Fig 3發(fā)現(xiàn)，LPS刺激15 min，可顯著升高TNF-α、IL-6(P<0.01)，并抑制IL-10(P<0.01)的表達(dá)。與LPS組相比，CTS處理組IL-10表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，而TNF-α和IL-6的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)，且CTS處理時間越長，這種作用越明顯。結(jié)果表明，CTS可抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌的促炎因子的表達(dá)。

2.4 CTS對巨噬細(xì)胞NF-κB通路的影響NF-κB通路在炎癥反應(yīng)等病理過程中發(fā)揮重要作用，調(diào)控某些炎性因子如IL-6、TNF-α的活性，因此本實驗檢測IκB蛋白水平以及p65入核情況。由Fig 4A發(fā)現(xiàn)，10 μmol·L-1CTS可有效抑制LPS誘導(dǎo)的P65入核(P<0.01)。同時，F(xiàn)ig 4B表明LPS引起的IκB降解被CTS逆轉(zhuǎn)，且這種作用呈劑量依賴性。

Fig 2 Effect of CTS on the killing ability of bone marrow macrophages

2.5 巨噬細(xì)胞分型檢測大量研究表明，M2型巨噬細(xì)胞主要發(fā)揮抗炎功能，因此本研究下一步檢測CTS是否影響巨噬細(xì)胞極化。LPS和IL-4可分別誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型和M2型分化。已知精氨酸酶1(Arg1)、CD206及CD163是M2型的標(biāo)志[7]，而iNOS2、TNF-α、IL-6是M1型特異性標(biāo)志，因此作為本實驗的研究指標(biāo)。由Fig 5A可知，CTS預(yù)處理6 h能夠有效抑制巨噬細(xì)胞向M1型分化，這一結(jié)果與2.3相符合。從Fig 5B可看出，先給與CTS，可增強巨噬細(xì)胞對IL-4的反應(yīng)性。與IL-4組相比，CTS處理組Arg1、CD163、CD206表達(dá)大幅度增加，差異均有意義。

Fig 3 Effect of CTS on the expression of TNF-α, IL-10 and IL-6 released from bone marrow macrophages

Measurement of TNF-α, IL-6 and IL-10 secretion by q-PCR after treatment with LPS for 15 min in the presence or absence of CTS for 3 h and 6 h.**P<0.01vsnormal control;##P<0.01vsmodel control.

3 討論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，通過吞噬病原微生物、呈遞抗原，在抵抗細(xì)菌入侵、防止機(jī)體感染、抗腫瘤等方面發(fā)揮重要作用[8-10]。 巨噬細(xì)胞根據(jù)其功能可以分為兩種極化類型，即：經(jīng)典活化的M1型和替代活化(選擇性活化)的M2型。前者可由IFN-γ、LPS等誘導(dǎo)產(chǎn)生，主要分泌一些促炎因子，如TNF-α、IL-12、IL-1β等，在炎癥反應(yīng)初期發(fā)揮宿主免疫功能，常見表面標(biāo)志有HLA-DR、CD197。后者可由IL-4、IL-10及IL-13誘導(dǎo)形成，不分泌或低分泌促炎因子，主要降低炎癥反應(yīng)、促進(jìn)組織修復(fù)，在炎癥反應(yīng)后期發(fā)揮重要作用，其特異性表面標(biāo)志有CD163、CD206、CD209等。不同微環(huán)境下，這兩種極化類型可發(fā)生轉(zhuǎn)換，從而呈現(xiàn)出不同的功能。因此，深入研究巨噬細(xì)胞分型的具體機(jī)制，對理解多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展并提出治療方案具有重要意義。

CTS是丹參的主要脂溶性成分之一，在治療心血管疾病方面得到廣泛應(yīng)用。相對于其它藥理作用，目前尚未見關(guān)于CTS對巨噬細(xì)胞功能方面的報道。本研究證實CTS能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬并清除病原微生物，抑制炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)的同時促進(jìn)抗炎因子IL-10的表達(dá)，這與之前報道相符合[3]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)CTS可影響巨噬細(xì)胞極化平衡，明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型分化。NF-κB信號途徑是調(diào)控炎癥因子表達(dá)的關(guān)鍵途徑，最新研究表明這一信號途徑也是M2型巨噬細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[11]。我們據(jù)此推測，CTS的上述藥理活性很可能是通過抑制NF-κB信號途徑實現(xiàn)的。

Fig 4 Effect of CTS on the NF-κB signaling pathways

A: Detection of the amount of p65 in the nuclei by western blot after treatment with LPS for 15 min in the presence or absence of CTS for 6 h.##P<0.01vsnormal control;**P<0.01vsthe group treated with LPS only;B: Detection of IκB after treatment with LPS for 15 min in the presence or absence of CTS for 6 h.##P<0.01vsnormal control;*P<0.05,**P<0.01vsthe group treated with LPS only

Fig 5 Effect of CTS on the polarization of bone marrow macrophages

A: Measurement of TNF-α, IL-6 and iNOS2 secretion by q-PCR after treatment with LPS for 3 h in the presence or absence of CTS for 6 h.**P<0.01vsnormal control;##P<0.01vsthe group treated with LPS only; B: Measurement of Arg1, CD206 and CD163 secretion by q-PCR after treatment with IL-4 for 24 h in the presence or absence of CTS for 6 h.**P<0.01vsnormal control;##P<0.01vsthe group treated with IL-4 only

已有研究表明M1 / M2平衡失調(diào)在多種疾病，如腫瘤、心血管疾病、肥胖中廣泛存在，直接影響著這些炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。如在腎臟、消化道等疾病發(fā)病過程中巨噬細(xì)胞M1 / M2比例升高，此時清除M1，活化M2型巨噬細(xì)胞成為消除炎癥、修復(fù)損傷的有效手段。目前已用于應(yīng)用的有治療胃腸道疾病的羅格列酮[12]，抗肥胖的替米沙坦[13]等。因此，以M2為靶點的藥物研發(fā)已成為目前的研究熱點。

綜上所述，CTS可增強巨噬細(xì)胞免疫功能，其抗菌消炎作用可能與其影響巨噬細(xì)胞極化過程有關(guān)。同時，研究結(jié)果表明CTS可用于干預(yù)巨噬細(xì)胞極化，扭轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞已偏移的極化平衡，將有可能從新的角度在多種免疫相關(guān)性疾病中發(fā)揮重要作用。

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Effects of cryptotanshinone on the function of bone marrow macrophages

YOU Yan1, ZHOU Chun1, LI Cui-xian1, LI Dong1, SHAO Wei-wei1,PENG Jin1, LI Wan-zhen1, LIU Pei-qing1, SHEN Xiao-yan1,2

(1.LaboratoryofPharmacologyandToxicology,SchoolofPharmaceuticalSciences,SunYat-SenUniversity,Guangzhou510006,China;2.DeptofPharmacology，SchoolofPharmacy，F(xiàn)udanUniversity，Shanghai201203,China)

Aim To investigate the role of cryptotanshinone in the fuction of bone marrow macrophages. Methods The role of cryptotanshinone in phagocytosis of bacterial components and sterilization by macrophages were assessed. The levels of TNF-α, IL-6 and IL-10 were measured by q-PCR. IL-4 and LPS were used to analyze the polarization of macrophages. Finally, the NF-κB signaling pathway was evaluated by western blot. ResultsExvivoexperiments showed that cryptotanshinone could enhance both phagocytosis of bio-particles and bactericidal ability and promote the expression of anti-inflammatory factor IL-10 while inhibiting TNF-α and IL-6 in a time-dependent manner. The experiments also demonstrated that macrophages were polarized to M2 in the presence of cryptotanshinone, and this effect might attribute to the NF-κB signaling pathway. Conclusion Cryptotanshinone can effectively enhance the immune function of bone marrow macrophages.

cryptotanshinone; macrophage; phagocytosis; sterilization; TNF-α; polarization

時間：2015-3-3 11:08 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150303.1108.011.html

2014-11-15,

2014-12-25

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81371923，81173056)；中山大學(xué)校級新藥研發(fā)課題資助項目(No 36000-31650005)

游 艷(1990-)，女，碩士生，研究方向：分子免疫學(xué)，E-mail: yanyou1990@ 126.com； 沈曉燕(1968-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：分子免疫學(xué)、藥物藥理與毒理學(xué)，通訊作者，Tel: 021-65642662，E-mail: shxiaoy@fudan.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.03.011

A

1001-1978(2015)03-0346-05

R-332；R284.1；R329.24；R392.12