徐 紅， 安 冬， 殷盛明， 陳 薇， 趙 丹， 孟 旭， 于德欽， 孫藝平,， 趙 杰, 張萬琴

(大連醫(yī)科大學 1. 生理學教研室， 2. 機能實驗室， 3. 2012/3級， 遼寧 大連 116044)

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蝎源活性肽對帕金森病大鼠凋亡因子改變的影響*

徐 紅2， 安 冬3， 殷盛明1△， 陳 薇3， 趙 丹3， 孟 旭3， 于德欽1， 孫藝平1,2， 趙 杰1, 張萬琴1

(大連醫(yī)科大學 1. 生理學教研室， 2. 機能實驗室， 3. 2012/3級， 遼寧 大連 116044)

目的：研究早期帕金森病(PD)大鼠腦內凋亡因子的改變及蝎源活性肽的保護作用。方法：選取健康雄性SD大鼠，體重為180～220 g，隨機分為4組(n=10)：早期PD模型組、假手術對照組、單獨蝎源活性肽處理組和蝎源活性肽治療組。采用6羥多巴胺(6-OHDA)制備大鼠PD早期模型，免疫組化觀察大鼠黑質致密部和紋狀體尾狀核處Bax和Bcl-2免疫反應陽性顆粒數(shù)量和光密度的變化，觀察大鼠PD發(fā)病早期腦內促進凋亡的Bax和抑制凋亡的Bcl-2的表達情況，進一步觀察蝎源活性肽保護作用的抗凋亡機制。結果：發(fā)現(xiàn)在6-OHDA給藥側，PD早期大鼠與對照組相比，腦內促進凋亡的Bax表達增強，而抑制凋亡的Bcl-2表達減弱，而蝎源活性肽可有效的逆轉這種異常的表達。結論：早期PD大鼠促進凋亡的Bax表達增強和抑制凋亡的Bcl-2表達減弱參與PD的早期病變，而抗凋亡機制參與了蝎源活性肽對中腦多巴胺能神經(jīng)元的早期保護作用。

帕金森??； 蝎源活性肽； Bcl-2; Bax；大鼠

帕金森病(Parkinson’s disease, PD) 是以運動障礙為特征的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]，其基本病理改變?yōu)檫x擇性中腦黑質多巴胺能神經(jīng)元進行性丟失[2]。PD從發(fā)病到有典型的臨床表現(xiàn)需要很長的時間，最新研究顯示甚至在新生兒期的腦內炎性損傷是導致幾十年后PD的原因之一[3]。PD的早期診斷和治療具有重要的意義，但是有關PD早期的發(fā)病機制尚未闡明。細胞凋亡參與PD的發(fā)病機制，抗凋亡也是PD治療中關注的熱點之一[4]?？沟蛲龌駼cl-2和促凋亡基因Bax是否參與早期PD的發(fā)病，少見報道。6-羥多巴胺( 6-hydrxydopamine, 6-OHDA )可在體外誘導多巴胺能神經(jīng)元的凋亡[5，6]。6-OHDA大鼠是研究PD防治的理想模型，將其注射到紋狀體后，大鼠黑質紋狀體系統(tǒng)將發(fā)生緩慢的退行性病變，在紋狀體一側注射小劑量6-OHDA能夠建立有PD早期病理特征的動物模型[7]。目前用于PD常規(guī)治療的左旋多巴制劑經(jīng)長期使用，藥效降低，副作用大[8]。已有資料記載蝎毒可用于PD的治療[9]，但其機制尚不清楚。我們前期研究已發(fā)現(xiàn)蝎源活性肽可保護1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶(MPTP) 小鼠 PD模型[10]中腦黑質內多巴胺能神經(jīng)元，蝎源活性肽可以保護早期6羥多巴大鼠腦內的多巴胺能神經(jīng)元[11]。本研究采用6-OHDA早期PD大鼠模型，旨在觀察大鼠PD早期腦內促進凋亡的Bax和抑制凋亡的Bcl-2的表達情況，進一步觀察蝎源活性肽保護作用的抗凋亡機制。為研究PD的早期診斷和防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

1.1.1 藥品與試劑 所用藥品包括6-OHDA(美國Sigma 公司)、Bcl-2與Bax抗體(Sigma公司)、生物素化的羊抗兔的IgG(武漢Boster公司)和蝎源活性肽(提取于東亞鉗蝎，本課題組專利，ZL0116116-9)。

1.1.2 儀器 所用儀器為ZPQ-86型振動切片機(上海海天電子儀器有限公司)、DKI5600型腦立體定位儀(美國)和HPIAS 系列彩色病理圖文分析系統(tǒng)(華海電子有限公司)。

1.2 實驗動物與分組

1.2.1 實驗動物 所用實驗動物為SD大鼠(大連醫(yī)科大學動物實驗中心，許可證號為SCXXⅡ2008002)。健康雄性SD大鼠，體重為180～220 g，隨機將實驗動物分為4組(n=10)：早期PD模型組、假手術對照組、單獨蝎源活性肽處理組和蝎源活性肽治療組。

1.2.2 蝎源活性肽處理 單獨蝎源活性肽對照組和蝎源活性肽治療組在完成行為學測試后給予蝎源活性肽(2.20 mg/(kg·d), ip)一周，早期PD模型組只給予生理鹽水(NS，2 ml/kg)。蝎源活性肽劑量依據(jù)前期的研究和預實驗。

1.2.3 PD動物模型制備 實驗動物經(jīng)腹腔注射4%水合氯醛(400 mg/kg)，麻醉后將其固定在腦立體定位上，門齒桿長為3.4 mm。依據(jù)大鼠腦定位圖譜(George Paxinos Charles Watson)來選取給藥的靶點，紋狀體為早期 PD的給藥靶點，具體的定位靶點為 AP=+1.0(前囟前)，R=3.0 mm(右旁開)，H=-4.5 mm(硬膜下)。早期PD的模型組和蝎源活性肽治療組的動物按照前述靶點定位，于腦內定點注射6-OHDA， 將6-OHDA溶解于Vehicle，內含0.1%抗壞血酸和0.9% NaCl，濃度為20 μg/3 μl。藥物注射的時間約為3 min，留針約3 min之后再慢慢退出。假手術對照組的動物在同等條件下，于靶點內注射容量相同的Vehicle。

1.3 觀察指標

1.3.1 動物旋轉行為檢測 術后兩周，所有的實驗動物都在頸部皮下注射0.4 ml阿樸嗎啡，劑量為0.5 mg/kg，在30 min內觀察并記錄誘導出的旋轉行為，小于7 r/min的左旋鼠視為模型成功的標志。

1.3.2 邁步試驗 采用1.1 m長木板，將其傾斜放置，一端與鼠籠連接。在3 d內，訓練大鼠在木板爬行，之后回到籠內并適應實驗環(huán)境。在正式實驗中，實驗者用右手固定大鼠的雙后肢，將其輕輕上提，使實驗動物離開桌面，用左手固定其一側前肢，讓其未固定的另一側前肢能夠接觸桌面。待該前肢可以自動移動的時候開始計時。記錄開始邁步直到返回鼠籠的時間和動物爬行在斜面上的步數(shù)。先檢測左側，之后是右側，重復2次。

1.3.3 免疫組織化學反應 采用免疫組織化學染色(ABC法)來檢測抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax的免疫反應活性。選取實驗動物的切片，定位為中腦黑質，采用PBS漂洗振蕩共3次(10 min/count)。PBS(含1%過氧化氫)處理10 min以清除內源性的過氧化物酶。PBS漂洗振蕩共3次(10 min/count)，PBS(含1%牛血清蛋白)封閉30 min。分別加入抗Bcl-2和Bax一抗抗體，在4℃下進行孵育過夜。PBS漂洗共3次(10 min/count)，加入生物素化的二抗在室溫下孵育1.5 h；漂洗三次后再與卵白素-生物素的復合物A∶B∶PBS(1∶1∶200)在室溫下進行振蕩孵育1 h，漂洗充分后再用現(xiàn)配的含有0.05%的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)-PBS的緩沖液顯色，顯色后終止反應，梯度脫水，二甲苯透明之后采用中性樹脂進行封片。

1.3.4 免疫染色陽性細胞的計數(shù) 采用病理圖文分析系統(tǒng)來定量分析Bcl-2和Bax免疫反應(IR)陽性的細胞(n=6)。根據(jù)George Paxinos Charles Watson大鼠的腦圖譜選取腦片的部位，10倍物鏡下觀察后，選取紋狀體和黑質致密部(substantia nigra compact, SNC)，測量框的面積是20 000 μm2(100 μm×200 μm)，在上下左右四個部位進行計數(shù)，計算并采用其平均值。計算并分析框內Bcl-2和Bax-IR陽性的細胞個數(shù)。分別在選取腦區(qū)范圍內的上下左右四個象限內隨機選擇6個Bcl-2和Bax-IR陽性的細胞，測定其胞漿的平均灰度。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 行為學結果

在邁步實驗中，與蝎源活性肽治療組相比，早期PD模型組的大鼠在其左前肢邁步開始至返回到鼠籠所需總時間和邁步的數(shù)目沒有明顯的差異。

2.2 Bax和Bcl-2免疫組化的變化

2.2.1 Bax和Bcl-2免疫組化圖像結果 Bax和Bcl-2免疫組化結果顯示與假手術對照組相比，6-OHDA處理的早期PD動物黑質致密部SNC和紋狀體尾狀核處(striatum caudate putamen, CPu)的Bax和Bcl-2出現(xiàn)異常表達，促進凋亡的Bax陽性表達的免疫反應活性增強 (圖1B、E，見彩圖頁Ⅲ)；而抑制凋亡的Bcl-2陽性表達的免疫反應活性減弱(圖2B、E，見彩圖頁Ⅲ)，蝎源活性肽治療組能夠有效逆轉這種增強或減弱的趨勢。單獨蝎源活性肽處理組與假手術對照組相比，無明顯差異，所以結果中未展示。

2.2.2 Bax和Bcl-2免疫組化陽性顆粒數(shù)量和光密度統(tǒng)計的變化 Bax和Bcl-2免疫組化結果統(tǒng)計顯示，與假手術對照組相比，6-OHDA處理的早期PD動物黑質致密部和紋狀體處促進凋亡的Bax的陽性顆粒數(shù)與吸光度值均顯著增多；而抑制凋亡的Bcl-2的陽性顆粒數(shù)與吸光度值均顯著下降，蝎源活性肽治療組能夠有效逆轉這種增多或減少的趨勢(P<0.05，P<0.01，表1、表2)。單獨蝎源活性肽處理組與假手術對照組相比，無明顯差異，所以結果中未展示。

Tab. 1 Analysis of immunohistochemistry results of Bax in the SNC and CPu of the rats

GroupNumberSNCCPuODSNCCPuSham2．20±0．423．80±0．54124．20±3．71123．25±6．80EarlyPD3．85±0．60??5．45±0．84??138．15±1．96?135．75±5．28??Therapy2．00±0．59##3．30±0．89##122．95±6．98##122．50±4．03#

SNC： Substantianigra compact； CPu： Striatumcaudate putamen*P<0.05,**P<0.01vssham group；#P<0.05,##P<0.01vstherapy group

Tab. 2 Analysis of immunohistochemistry results of Bcl-2 in the SNC and CPu of the rats

GroupNumberSNCCPuODSNCCPuSham4．20±0．455．40±0．86130．22±5．33124．90±0．98EarlyPD2．50±0．18??2．40±0．20??118．36±3．66??103．90±2．08?Therapy4．10±0．60##5．15±0．52##129．47±3．66##124．00±1．36#

SNC： Substantianigra compact； CPu： Striatumcaudate putamen*P<0.05,**P<0.01vssham group；#P<0.05,##P<0.01vstherapy group

3 討論

PD是一種以靜止性震顫、動作遲緩及減少等癥狀為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)退行性疾病，主要發(fā)生于中老年人。50歲之后PD發(fā)病率超過1%[12]。PD顯著的病理學特征是中腦黑質致密部多巴胺能神經(jīng)元脫失引起紋狀體多巴胺分泌不足，進而導致基底節(jié)神經(jīng)調節(jié)功能的紊亂[13]。目前帕金森病的發(fā)病機制尚不明確[14,15]，細胞凋亡可能是PD發(fā)生過程中多巴胺能神經(jīng)元死亡的共同通路[16]。Matus等[17]研究發(fā)現(xiàn)，PD患者的黑質神經(jīng)元凋亡明顯增加，還有報道細胞凋亡可能在PD的黑質多巴胺能神經(jīng)元死亡中發(fā)揮重要作用[18]，并提出了在PD治療過程中可采用抗細胞凋亡的方法。因此，對神經(jīng)元的保護和抗細胞凋亡療法已成為PD治療的主要思路之一。

細胞凋亡是由基因控制的細胞自主的有序的死亡，是相對細胞壞死而言的另一種細胞死亡方式。細胞內存在兩種具有相反功能的與凋亡相關的基因：促凋亡基因(Bax、Bak等)和抗凋亡基因(Bcl-2、Bcl-XL等)。在黑質DA能神經(jīng)元凋亡的調控中，Bcl-2蛋白表達水平的下降，會引起B(yǎng)ax蛋白同源二聚體形成，從而促進DA能神經(jīng)元凋亡；當Bcl-2蛋白表達水平上調時，Bax蛋白同源二聚體解聚，促使Bcl-2與Bax兩種蛋白異源二聚體形成，抑制DA能神經(jīng)元凋亡。有研究表明，Bax與Bcl-2的比值影響細胞凋亡過程，Bax/Bcl-2值升高可促進細胞凋亡[19]。Miyashita等[20]研究證實，Bax是包括6-OHDA所致紋狀體內DA能神經(jīng)元損傷等各種神經(jīng)細胞損傷的啟動因素之一，Bax的過表達會導致細胞色素C釋放增多，Apaf-1變構加速，作用于Caspase前體，使其活化，從而激活Caspase級聯(lián)凋亡程序[21]。Bcl-2能夠促進DNA損傷修復，調節(jié)細胞內Ca水平，減少線粒體釋放細胞色素C進入胞漿[22]。

目前，PD的治療多采用針對性補充多巴胺等對癥治療，隨著治療時間的增長，藥物對癥治療效果越來越差，靜止性震顫、肌肉僵直等癥狀日漸明顯，嚴重影響患者的生活質量并加重其經(jīng)濟負擔[23]。因此，探討PD的發(fā)生機制并尋找性價比高的對癥藥物成為目前研究的熱點。蝎毒作為我國傳統(tǒng)中藥, 早有記載可用于治療PD[8]。本研究在大鼠紋狀體一側注射小劑量6-OHDA，制備PD早期動物模型，經(jīng)旋轉行為實驗與邁步實驗檢測，實驗組與對照組沒有明顯的差異，可證實早期PD大鼠模型制備成功[24-26]。我們研究發(fā)現(xiàn)蝎源活性肽對早期PD大鼠多巴胺能神經(jīng)元具有保護作用[11]，進而通過更深一步研究觀察到早期PD大鼠相對于對照組而言，其6-OHDA損毀側中腦促進凋亡的Bax陽性表達免疫反應活性增強，而抑制凋亡的Bcl-2陽性表達免疫反應活性減弱，而蝎源活性肽可有效的逆轉這種異常的表達。表明促進凋亡的Bax表達增強和抑制凋亡的Bcl-2表達減弱參與PD的早期病變，而抗凋亡機制參與了蝎源活性肽對中腦多巴胺能神經(jīng)元的早期保護作用。推測蝎源活性肽可能通過促進Bcl-2的表達和抑制Bax的表達，達到抑制神經(jīng)細胞的凋亡來減少多巴胺神經(jīng)元的丟失，從而發(fā)揮抗PD作用。

綜上所述，PD發(fā)病與細胞凋亡密不可分。Bax可啟動并誘導黑質DA能神經(jīng)元凋亡，是一種前凋亡蛋白，而Bcl-2可通過調控DNA損傷修復來抑制細胞凋亡。所以，干擾Bax蛋白表達，使其表達水平下調等抑制細胞前凋亡步驟的方法以及調節(jié)Bax/Bcl-2比值在臨床治療中具有重大意義。相信隨著對PD多巴胺能神經(jīng)元凋亡發(fā)病機制與蝎源活性肽藥用價值的進一步研究，蝎源活性肽抗DA能神經(jīng)元凋亡治療PD一定會得到充分的認識和發(fā)展，為PD的預防與治療提供了又一重要的理論依據(jù)。

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The alterations of apoptosis factor Bcl-2/Bax in the early Parkinson’s disease rats and the protective effect of scorpion venom derived activity peptide

XU Hong2, AN Dong3, YIN Sheng-ming1△, CHEN Wei3, ZHAO Dan3, MENG Xu3, YU De-qin1, SUN Yi-ping1,2, ZHAO Jie1, ZHANG Wan-qin1

(Dalian Medical University 1. Department of Physiology， 2. Functional Laboratory， 3. 2012/3 grade students， Dalian 116044， China)

Objective: To explore the alterations of apoptosis factor Bcl-2/Bax in the early Parkinson’s disease (PD) rats and the protective effect of scorpion venom derived bioactive peptide. Methods: Healthy male SD rats (180～220 g) were randomly divided into 4 groups (n=10): early PD model group, sham operation group, scorpion venom derived bioactive peptide control group, scorpion venom derived bioactive peptide therapy group. 6-hydroxydopamine (6-OHDA) was used to prepare the early PD rat model. The immunohistochemistry was used to detect the expression of Bax and Bcl-2 and further explore the mechanism of anti-apoptosis regarding the neuroprotective effect of scorpion venom derived bioactive peptide. Results: The results indicated that compared with the control rats, the immunostaining of Bax in the brain increased significantly while that of Bcl-2 decreased significantly in the lesion side of 6-OHDA treated rats. Interestingly, scorpion venom derived bioactive peptide could attenuate the above abnormal changes. Conclusion: Up-regulation of Bax and down-regulation of Bcl-2 could participate in the early stage of PD and the anti-apoptotic mechanism could be involved in the neuroprotective effect exerted by scorpion venom derived activity peptide regarding the dopaminergic neuron in the early stage.

Parkinson’s disease； scorpion venom derived activity peptide； Bcl-2； Bax； rats

國家自然科學基金資助項目(31201724)；遼寧省大學生科研創(chuàng)新活動(201310161008)

2014-12-15

2015-02-10

R741

A

1000-6834(2015)03-225-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.008

△【通訊作者】Tel： 0411-86110288； E-mail: dlshengming@163.com