劉雙雙， 黃繼云， 肖桂鳳， 尹 偉， 林趙肖楠, 盧應(yīng)梅

(1. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)成像平臺(tái)， 2. 浙江大學(xué)毒理與生化藥學(xué)研究所， 杭州310058；3. 浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 杭州 310015)

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雙光子顯微鏡檢測(cè)活體小鼠腦內(nèi)微循環(huán)技術(shù)的建立*

劉雙雙1， 黃繼云2， 肖桂鳳1， 尹 偉1， 林趙肖楠1, 盧應(yīng)梅3△

(1. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)成像平臺(tái)， 2. 浙江大學(xué)毒理與生化藥學(xué)研究所， 杭州310058；3. 浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 杭州 310015)

目的：利用正置雙光子顯微鏡系統(tǒng)和熒光探針標(biāo)記技術(shù)，觀(guān)察活體小鼠腦內(nèi)血管的三維立體分布，建立測(cè)量單根毛細(xì)血管血流速度的新方法。方法：麻醉小鼠，制作活體小鼠顱骨開(kāi)窗樣本，尾靜脈注射血漿標(biāo)記物Texas-Red dextran，利用雙光子顯微鏡z序列掃描檢測(cè)腦內(nèi)微循環(huán)系統(tǒng)的三維分布；利用線(xiàn)掃描測(cè)量毛細(xì)血管的血流速度。結(jié)果：通過(guò)雙光子顯微鏡可以探測(cè)到腦內(nèi)500 μm處的血管分布和走向，圖像清晰且信噪比高；通過(guò)計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)紅細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)距離測(cè)得毛細(xì)血管(直徑≤6 μm)的血流速度為(0.59±0.12) mm/s。結(jié)論：利用雙光子顯微鏡觀(guān)察腦內(nèi)微循環(huán)系統(tǒng)技術(shù)平臺(tái)初步建立，為基礎(chǔ)研究和醫(yī)藥應(yīng)用提供了在體實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

雙光子顯微鏡；大腦皮層；微循環(huán)；血流速度

健全的微循環(huán)功能是保證大腦執(zhí)行正常功能的首要前提，當(dāng)微循環(huán)發(fā)生障礙時(shí)，血液流速減慢易形成血栓，導(dǎo)致局部腦組織缺血、缺氧甚至壞死，引起一系列臨床癥狀。醫(yī)學(xué)研究已證明：人體衰老、高血壓、糖尿病及多種心腦血管疾病都與腦微循環(huán)障礙密切相關(guān)。血液動(dòng)力學(xué)是表征血液循環(huán)系統(tǒng)的流動(dòng)參數(shù)，是反映微循環(huán)功能變化的重要指標(biāo)，因此血液動(dòng)力學(xué)變化的檢測(cè)對(duì)于研究腦微血管功能，延緩上述重大疾病發(fā)展具有重要意義。

檢測(cè)微循環(huán)血液動(dòng)力學(xué)具有多種方法，傳統(tǒng)檢測(cè)血流的方法有核磁共振、斷層掃描和光譜學(xué)方法。這些方法能夠測(cè)定血液流量、氧化作用，但只能測(cè)出整體血流量，不能細(xì)微到單根血管。后來(lái)又有光學(xué)檢測(cè)方法，由于使用的是場(chǎng)光源，使得圖像的對(duì)比度和分辨率較低，無(wú)法實(shí)現(xiàn)活體動(dòng)物在體觀(guān)察；共聚焦顯微鏡由于探測(cè)針孔的存在，使得成像深度也只有幾十個(gè)微米，無(wú)法深入到活體腦深部進(jìn)行微血管檢測(cè)。因此建立精確檢測(cè)腦微血管系統(tǒng)特別是腦微血管血流參數(shù)變化的計(jì)數(shù)方法具有重要意義。雙光子顯微鏡成像是近年來(lái)出現(xiàn)的新技術(shù)，具有高信噪比、高穿透性、低漂白性等特性，更適合檢測(cè)組織中深層結(jié)構(gòu)或者活體內(nèi)部結(jié)構(gòu)[1]。如果能有效借助于雙光子顯微鏡技術(shù)開(kāi)展相關(guān)工作，將為缺血性腦中風(fēng)、老年癡呆、糖尿病等疾病的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也將通過(guò)探索休止的、激活的、損傷的、新生的腦微血管的調(diào)控機(jī)制，為開(kāi)發(fā)保護(hù)腦微循環(huán)的新型藥物、防治心腦血管疾病開(kāi)辟?gòu)V闊的前景。本工作利用雙光子顯微鏡和熒光染料負(fù)載技術(shù)觀(guān)察活體小鼠腦內(nèi)微循環(huán)系統(tǒng)的三維分布，測(cè)量腦內(nèi)單根毛細(xì)血管的血流速度。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

主要試劑：低熔點(diǎn)瓊脂糖(Sigma公司)，人工腦脊液(mmol: NaCl 125, KCl 3, glucose 10, NaHCO326, NaH2PO41.1, CaCl22, MgSO41)，Texas Red dextran(Invitrogen, D1830)，70%消毒酒精，水合氯醛，生理鹽水，雙氧水(上海生工)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和設(shè)備： 1月齡健康、清潔級(jí)Balb/c小鼠，體重18～20 g(購(gòu)自浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。正置雙光子顯微鏡(Olymupus正置顯微鏡， 型號(hào)：BX61WI-FV1000，四通道多光子熒光探測(cè)器，×25超級(jí)消復(fù)色差物鏡，F(xiàn)V1000驅(qū)動(dòng)軟件)，MaiTai飛秒激光器(波長(zhǎng)690～1020 nm連續(xù)可調(diào))，腦立體定位儀，蓋玻片，眼科彎鑷，牙科電鉆，腦固定鐵圈和長(zhǎng)柄鐵塊。

1.2 小鼠大腦顱骨開(kāi)窗手術(shù)

1.2.1 動(dòng)物麻醉 選取1月齡的Balb/c小鼠(18～20 g)，腹腔注射3%水合氯醛，注射劑量為1.35～1.4 ml/100 g。

1.2.2 開(kāi)顱前準(zhǔn)備 將麻醉的小鼠用剃須刀剃去腦表面的毛發(fā)，眼科剪刀剪去頭皮，用蘸有雙氧水的棉簽擦拭腦表面以除去表面的筋膜，然后用蘸有人工腦脊液的棉簽擦拭頭骨以保持濕潤(rùn)。

1.2.3 顱骨開(kāi)窗手術(shù) 將麻醉的小鼠用腦立體定位儀進(jìn)行固定，用牙科電鉆小心地打磨待觀(guān)察區(qū)域邊緣的頭骨，開(kāi)窗區(qū)域大約為6×6 mm的圓孔，為了降低出血量，在用電鉆打磨過(guò)程中，選擇中等刃徑的鉆頭，待頭骨邊緣呈半透明狀態(tài)后輕輕按壓頭骨，觀(guān)察到邊緣軟化即可停止，用眼科彎鑷小心地從邊緣夾取頭骨將其輕輕地掀掉，此過(guò)程要求動(dòng)作輕微，盡量避免出血，以免影響成像，并用人工腦脊液多次清洗窗口，直至沒(méi)有血液出現(xiàn)。

1.2.4 開(kāi)窗區(qū)的密封和固定 將配好的瓊脂糖涼至室溫，滴到開(kāi)窗的腦表面，上面蓋蓋玻片(直徑為8×8 mm)以抑制呼吸節(jié)律對(duì)成像產(chǎn)生的影響。用制備好的牙膏粉將鐵圈封在蓋玻片的外圍，保證開(kāi)孔處在鐵圈中央，最后將鐵圈固定在長(zhǎng)柄鐵塊上，使成像時(shí)老鼠大腦始終固定[2]。

1.3 熒光染料的標(biāo)記

制備終濃度為0.5 mg/ml 的Texas-Red溶液，尾靜脈按0.01 ml/g動(dòng)物體重注射，15 min后經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入全身可進(jìn)行成像。

1.4 雙光子顯微鏡觀(guān)察

利用Olympus正置雙光子顯微鏡裝置進(jìn)行成像，激發(fā)光波長(zhǎng)選取860 nm，發(fā)射的熒光通過(guò)外置探測(cè)器接收，使用雙色鏡(DM560)結(jié)合帶寬濾色片(575～640)探測(cè)血漿發(fā)出的熒光。利用z序列掃描觀(guān)察腦內(nèi)脈管系統(tǒng)的三維分布，掃描速度為2 μs/pixel，掃描步徑為2 μm，圖像大小為512×512個(gè)像素；利用線(xiàn)掃描測(cè)量單位時(shí)間內(nèi)紅細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)距離，掃描速度為10 μs/pixel，連續(xù)掃描2 000張。

1.5 圖像記錄和數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 在體雙光子成像系統(tǒng)的組成

雙光子顯微鏡系統(tǒng)主要由飛秒激光器、掃描振鏡、物鏡、探測(cè)器、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)組成。成像流程為：鈦-藍(lán)寶石激光器輸出脈沖激光，經(jīng)過(guò)反射鏡反射到達(dá)擴(kuò)束鏡，激光束被調(diào)整為強(qiáng)度均勻的平行光束，光束到達(dá)掃描振鏡，透過(guò)二色鏡，經(jīng)過(guò)物鏡匯聚到樣品上，樣品被激發(fā)后發(fā)出熒光，經(jīng)二色鏡反射到達(dá)探測(cè)器，信號(hào)被數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)收集(圖1A)。小鼠麻醉后，將其固定在腦立體定位儀上進(jìn)行顱骨開(kāi)窗手術(shù)(圖1B)，顱骨開(kāi)窗后，用牙膏水泥將腦固定圈固定在開(kāi)窗區(qū)外的顱骨上，并通過(guò)螺絲將其固定到長(zhǎng)柄鐵塊上(圖1C)，最后將制備好的動(dòng)物樣本放置在雙光子顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察(圖1D)。

2.2 腦內(nèi)微循環(huán)的三維立體分布

小鼠顱骨開(kāi)窗后，尾靜脈注射Texas-Red染料，經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)全身血管，15 min后，將小鼠放置在雙光子顯微鏡載物臺(tái)上，激發(fā)光調(diào)至860 nm，調(diào)節(jié)焦平面選取血管密集區(qū)，利用×25物鏡進(jìn)行雙光子掃描成像。通過(guò)雙光子顯微鏡z序列掃描，探測(cè)腦內(nèi)較深區(qū)域的血管分布和走向，通過(guò)優(yōu)化設(shè)置，成像深度達(dá)到腦內(nèi)500 μm處，能夠清楚的看到腦內(nèi)血管走向及分支(圖2A)，其中300 μm以?xún)?nèi)成像信噪比(S/N)較高。利用共聚焦顯微鏡成像僅能探測(cè)到腦內(nèi)100 μm處的熒光信號(hào)(圖2B)。

Fig. 1 Schematic diagram of in vivo two photon imaging and imaging apparatus A: Schematic diagram of two-photon laser scanning microscopy imaging; B: Skull exposure is achieved in a stereotactic frame; C: Brain fixation devices: long handle iron and brain retainer ring; D: Example of an anesthetized mouse during two-photon imaging

Fig. 2 Three-dimensensional reconstruction of cortical vasculatureinvivoA: Three-dimensional reconstruction of cortical vasculature by two-photon microscopy; B: Three-dimensional reconstruction of cortical vasculature by confocal microscopy

2.3 血流速度的量化方法

尾靜脈注射Texas-Red后，染料僅能標(biāo)記血漿而不進(jìn)入紅細(xì)胞，利用雙光子顯微鏡進(jìn)行線(xiàn)掃描時(shí)，隨著掃描時(shí)間的變化，紅細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡形成暗影。如示意圖所示(圖3A)：x軸為紅細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的距離，y軸為掃描時(shí)間，黑色的圓圈代表紅細(xì)胞，隨著時(shí)間變化紅細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)形成一條黑色斜線(xiàn)，通過(guò)計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)紅細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)距離量化血流速度，紅細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率表示為Δx/Δt，血流方向?yàn)樾甭实淖呦?圖3B)。

Fig. 3 Movement locus for red blood cell by two photon microscopy line scanning A: Illustration of red blood cell flow in a capillary； B: Movement locus of red blood cells by two photon microscopy line scanning

2.4 毛細(xì)血管血流速度的測(cè)定

選取5只健康小鼠(體重20～25 g)，在腦內(nèi)(200～250) μm處選取直徑小于6 μm的毛細(xì)血管測(cè)量血流速度。每只小鼠選取10根血管進(jìn)行線(xiàn)掃描，掃描速度為10 μs/pix，連續(xù)掃描2 000幅，測(cè)得的紅細(xì)胞平均流速為(0.59±0.12)mm/s，血流經(jīng)線(xiàn)掃描后，斜率越大，單位時(shí)間內(nèi)紅細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)距離越短，血流速度越慢；單位長(zhǎng)度內(nèi)陰影越多，紅細(xì)胞數(shù)目越多(圖4)。

Fig. 4 Red blood cell velocity in capillary by line scanning

3 討論

與傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡成像方法比較，雙光子激發(fā)成像有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光比短波長(zhǎng)的光受散射影響較小容易穿透標(biāo)本；(2)雙光子成像不需要共聚焦針孔，這樣就提高了對(duì)熒光的吸收率，而收集率的提高使得圖像對(duì)比度提高；(3)長(zhǎng)波長(zhǎng)的近紅外光比短波長(zhǎng)的光對(duì)細(xì)胞毒性??；(4)使用雙光子顯微鏡觀(guān)察標(biāo)本的時(shí)候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性，所以雙光子顯微鏡比共聚焦顯微鏡更適合用來(lái)觀(guān)察厚標(biāo)本和活體組織[3]。通過(guò)光學(xué)顯微鏡或者共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察，只能在腦表面或者在腦切片上進(jìn)行，無(wú)法深入到活體腦內(nèi)部觀(guān)察，科研的發(fā)展需要細(xì)微到單個(gè)血管，跟蹤活體小鼠腦內(nèi)部微循環(huán)的變化，雙光子顯微鏡由于其穿透能力強(qiáng)、光毒性小等優(yōu)勢(shì)，使得觀(guān)察活體小鼠腦內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)成為可能。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用雙光子顯微鏡觀(guān)察活體腦內(nèi)血管分布和走向，能夠得到高分辨率的圖像。為了達(dá)到最好的成像效果，樣本制作過(guò)程盡量避免待觀(guān)察區(qū)的出血現(xiàn)象，過(guò)多的出血影響成像效果，因此，制備高質(zhì)量的活體樣本是完成實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。通過(guò)優(yōu)化手術(shù)過(guò)程，調(diào)節(jié)成像參數(shù)，利用雙光子專(zhuān)用鏡頭×25水鏡，探測(cè)到了活體腦內(nèi)500 μm處的熒光信號(hào)。2011年日本科學(xué)家Hiroshi Hama發(fā)現(xiàn)了一種新型的透明劑scale，利用這種透明及處理樣本后，能達(dá)到4 mm的成像深度，使用透明劑的樣本需經(jīng)過(guò)固定處理，所以尚未在活體上實(shí)現(xiàn)深度成像[4]。

結(jié)果還顯示通過(guò)熒光標(biāo)記技術(shù)，能測(cè)出單根血管內(nèi)紅細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速度。其原理為：尾靜脈注射Texas-Red熒光染料后，染料特異性標(biāo)記血漿，而不進(jìn)入紅細(xì)胞，當(dāng)進(jìn)行線(xiàn)掃描時(shí)，血漿部分發(fā)出紅色熒光，紅細(xì)胞則表現(xiàn)為黑色，紅細(xì)胞隨時(shí)間變化的運(yùn)動(dòng)軌跡形成了一條黑色暗影，通過(guò)計(jì)算紅細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速度和血管直徑量化血流速度。目前量化血流的方式有三種：血流量(血流量=血流速度x 血管直徑)、紅細(xì)胞線(xiàn)性密度(紅細(xì)胞的線(xiàn)性密度=血流量/血流速度)和紅細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度[5]。血液攜帶氧氣和營(yíng)養(yǎng)的能力與血流量成正比，檢測(cè)血流量需要測(cè)量紅細(xì)胞流動(dòng)速度和血管直徑，但是血流速度和血管直徑可以各自獨(dú)立發(fā)生改變，所以必須同時(shí)測(cè)量這兩個(gè)參數(shù)。而測(cè)定紅細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度的方法相對(duì)簡(jiǎn)單易行，其應(yīng)用更加廣泛。

利用雙光子顯微鏡成像活體動(dòng)物腦內(nèi)結(jié)構(gòu)，雖然能夠達(dá)到較深的成像深度，但是由于腦內(nèi)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，光散射和折射較強(qiáng)，隨著腦內(nèi)深度的增加，成像信號(hào)也會(huì)越弱，將會(huì)形成信號(hào)越來(lái)越弱的三維結(jié)構(gòu)。為了保持信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)一致，我們通過(guò)優(yōu)化設(shè)置，利用雙光子顯微鏡的z-bright功能，隨著焦點(diǎn)深度的增加，逐漸增加雙光子激光強(qiáng)度，光電倍增管電壓值，并將改變的信息進(jìn)行保存，進(jìn)行三維掃描時(shí)，不同的深度按照保存的信息進(jìn)行掃描，以保持在較深范圍仍然能夠得到強(qiáng)度相對(duì)均一的信號(hào)，獲得高信噪比圖像。

雙光子顯微鏡技術(shù)及其在活體成像記錄上的優(yōu)點(diǎn)為研究復(fù)雜的循環(huán)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能提供了一條新的途徑。但是目前也存在一些問(wèn)題：腦表面大血管血流速度快，線(xiàn)掃描后無(wú)法得到單個(gè)紅細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的陰影，因此測(cè)定大血管血流速度還需進(jìn)一步探索。腦開(kāi)顱手術(shù)過(guò)程中，如何減少損傷和感染，使動(dòng)物能長(zhǎng)期存活，實(shí)現(xiàn)對(duì)血流速度和血流方向的長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)監(jiān)測(cè)也值得進(jìn)一步探索。

[1] Svoboda K, Yasuda R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience[J].Neuron， 2006, 50(6)： 823-839.

[2] Mostany R, Portera-Cailliau C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging[J].JVisExp, 2008, 15(12): 680.

[3] Helmchen F, Denk W. Deep tissue two-photon microscopy [J].NatMethods, 2005, 2(12): 932-940.

[4] Hiroshi Hama, Hiroshi Kurokawa, Hiroyuki Kawano,etal. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain[J].NatNeurosci, 2011, 14(11): 1481-1488.

[5] Chaigneau E, Oheim M, Audinat E,etal. Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli.[J].ProcNatlAcadSciUSA， 2003, 100(22): 13081-13086.

In vivo imaging of blood flow using two-photon laser scanning fluorescent microscopy

LIU Shuang-shuang1, HUANG Ji-yun2, XIAO Gui-feng1, YIN Wei1, LIN Zhao-xiao-nan1, LU Ying-mei3△

(1. the Imaging Center, Core Facilities of Zhejiang University School of Medicine, 2. Institute of Pharmacology, Toxicology and Biochemical Pharmaceutics of Zhejiang University, Hangzhou 310058; 3. Zhejiang University City College of Medicine, Hangzhou 310015, China)

Objective: To observe the three-dimensional distribution of vessels, and to establish a new method for measurement of blood flow velocity in mice cerebral cortex using two-photon laser scanning microscopy and fluorescence probe labeling technique. Methods: The mouse was made cranial window surgery and injected Texas-Red through tail vein after anesthetized. The three-dimensional imaging of vessel was obtained through z-stack scanning, and blood flow velocity was quantified through line scanning. Results: We could detect vascular distribution for more than 500 μm depth using two-photon microscopy. The velocity of blood flow was (0.59±0.12) mm/s in capillary. Conclusion: The method for observing the brain blood flow by two-photon microscopy was established, which could achieve quantification of single vascular blood flow velocity and provide experimental evidence for basic research and medical applications.

two-photon microscopy; cerebral cortex; microcirculation; blood flow velocity

浙江省科技廳分析測(cè)試項(xiàng)目(2012C37060,2014C37068)；浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究項(xiàng)目(SYB201306, SYB201407)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助(519000*72210151)

2014-11-06

2015-03-03

Q334

A

1000-6834(2015)03-245-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.014

△【通訊作者】Tel: 0571-88206270; E-mail: lufx@zju.edu.cn