陳國(guó)妮，孫飛龍，閆亞茹，侯甜甜，文改改

（西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西西安 710048）

響應(yīng)面法優(yōu)化馬齒莧類黃酮超聲微波提取工藝

陳國(guó)妮，孫飛龍，閆亞茹，侯甜甜，文改改

（西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西西安 710048）

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面分析法，并利用Design Expert軟件優(yōu)化提取工藝參數(shù).結(jié)果表明，最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、提取時(shí)間40min、料液比1∶25時(shí)，總黃酮提取量10.363 8mg／g與理論預(yù)測(cè)值10.370 3mg／g接近.響應(yīng)面法可用于優(yōu)化馬齒莧類黃酮超聲微波聯(lián)用提取工藝，其優(yōu)化工藝參數(shù)可為馬齒莧類黃酮工業(yè)化生產(chǎn)提供參考.

馬齒莧；類黃酮；超聲－微波聯(lián)用；響應(yīng)面法；提取工藝

馬齒莧（Portulaca oleracea L.）為馬齒莧科一年生草本植物，藥食兩用，肥厚多汁，無(wú)毛，生于田野路邊等向陽(yáng)處，我國(guó)南北各地均有分布.現(xiàn)代研究表明，馬齒莧不但含有豐富的脂肪酸及維生素等營(yíng)養(yǎng)成分［1］，此外，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載馬齒莧還含有多種活性物質(zhì)，包含生物堿、類黃酮（也叫黃酮類化合物）、多糖、甾醇、有機(jī)酸、苷類、酚類化合物及油脂等成分［2］.馬齒莧含有較多的活性成分，使其具有多樣的活性功能，尤其是活性成分中的類黃酮，具有較強(qiáng)的抗菌抑菌、抗氧化和抗癌等多種藥效功能，因此有一定開發(fā)利用的必要［3］.目前，已見報(bào)道提取馬齒莧類黃酮的方法主要有溶劑提取法［4］、超聲波輔助提取［5］和微波輔助提?。?］等，文獻(xiàn)［7］使用超聲波法提取黃皮葉中的黃酮類化合物，結(jié)果顯示與常規(guī)的浸提法相比，超聲波法能縮短處理的時(shí)間.針對(duì)目前的類黃酮提取方法普遍存在提取效率不高等不足問(wèn)題，微波－超聲波聯(lián)用提取法作為一種高效綠色環(huán)保的高新技術(shù)，具有提取率高、工藝簡(jiǎn)單、污染小、低耗能和避免了對(duì)有效成分的不良影響等優(yōu)點(diǎn)［8］.

本文采用超聲－微波聯(lián)用提取法，運(yùn)用響應(yīng)面分析方法，研究超聲－微波聯(lián)合輔助技術(shù)提取馬齒莧類黃酮的最佳工藝，以便為馬齒莧進(jìn)一步分離純化和各性能的研究奠定基礎(chǔ)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)其大規(guī)模開發(fā)利用和產(chǎn)業(yè)化.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與方法

1.1.1 試劑與儀器 馬齒莧：采自西安市市郊.無(wú)水乙醇、氨水、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純.立式電熱鼓風(fēng)干燥箱：DGF－1AB型，天津市泰斯特儀器有限公司；電子天平：AL204，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；紫外可見分光光度計(jì)：752N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司制造；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：申科R－205型，上海申順生物科技有限公司；微波爐：KD21C－C2型，順德市美的微波爐制造有限公司；超聲波清洗器：SK5200LH型，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；多功能粉碎機(jī)：XS－04型，上海兆申科技有限公司；循環(huán)水式真空泵：SHZ－D（Ⅲ）型，鞏義市英峪予華儀器廠.

1.1.2 方法 （1）原料的預(yù)處理.馬齒莧除去殘根雜質(zhì)，洗凈，自然陰干后置于65℃烘箱中烘干.取出，用多功能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩成干粉，備用.（2）馬齒莧類黃酮的提取與測(cè)定.馬齒莧類黃酮的提取：稱取馬齒莧干粉1.0g放入250mL錐形瓶中，加入30mL的95%乙醇，在室溫下浸泡并搖勻，在50W的微波爐加熱10min，再放到50W的超聲波清洗器超聲30min.用真空泵抽濾處理后的馬齒莧乙醇提取液，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮（溫度70℃），獲得馬齒莧黃酮濃縮液，密封保存［9］.

類黃酮定性檢測(cè)：將提取液點(diǎn)于濾紙片上，置于氨水瓶口，顯微黃色，移開濾紙片數(shù)分鐘后，微黃色又消褪，說(shuō)明該提取物中含有類黃酮存在［10］.

馬齒莧總黃酮得率計(jì)算.取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用70%乙醇定容于10.0mL的容量瓶，配成標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行比色測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［11］.移取1.0mL黃酮提取液于10.0mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.4mL，靜置5min，10%硝酸鋁溶液0.4mL，靜置5min，4.2%氫氧化鈉溶液4.0mL，加蒸餾水標(biāo)定至刻度，搖勻，放置15min，以不加黃酮的混合溶液作為參比，依次加入樣品液，在波長(zhǎng)510nm下測(cè)其吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算總黃酮的濃度，按式（1）得到總黃酮提取率（Y）.測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁質(zhì)量濃度C（g／L）與吸光度A所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為C＝0.092 5A＋0.000 2，R2＝0.999 8.Y＝10×C×V／m.（1）

其中：Y為總黃酮得率（mg／g）；C為吸光度A時(shí)由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣品液的質(zhì)量濃度（g／L）；V為樣品液的體積（mL）；m為稱取樣品的質(zhì)量（g）.

1.2 單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)馬齒莧總黃酮提取條件的影響

1.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 依據(jù)方法1.1.2（2），在料液比1∶25，提取時(shí)間35min分析乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為75%，80%，85%，90%和95%對(duì)馬齒莧黃酮類化合物得率的影響.

1.2.2 提取時(shí)間的影響 依據(jù)方法1.1.2（2），在料液比1∶25，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，分析提取時(shí)間分別為30min，35min，40min，45min和50min對(duì)馬齒莧總黃酮得率的影響.

1.2.3 料液比的影響 依據(jù)方法1.1.1（2），在乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，分析料液比分別為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30對(duì)馬齒莧總黃酮得率的影響.

1.3 響應(yīng)面法優(yōu)化馬齒莧中總黃酮的提取條件

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用中心組合Box－Behnken［12－13］設(shè)計(jì)方案，設(shè)計(jì)的因素水平見表1，采用響應(yīng)面法分析該三因素對(duì)總黃酮得率的影響，并優(yōu)化其提取條件.

表1 中心組合Box－Behnken因素水平表Table 1 Center combination Box－Behnken factors level table

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)馬齒莧總黃酮得率的影響

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響不同，測(cè)定結(jié)果如圖1所示.從圖1可以看出，總黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于80%時(shí)，總黃酮得率開始下降.根據(jù)溶液的相似相溶原理，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，總黃酮能最大溶出，得率達(dá)到最大，與黃酮極性相關(guān).

2.2 提取時(shí)間對(duì)馬齒莧總黃酮得率的影響

不同提取時(shí)間對(duì)馬齒莧總黃酮得率的影響結(jié)果如圖2所示.由圖2可以看出，在35min之前，總黃酮得率隨提取時(shí)間的增加而上升，提取時(shí)間達(dá)到35min時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最大.原因?yàn)槌暎⒉▽?duì)馬齒莧細(xì)胞壁破壞效果較佳，35min之后總黃酮得率逐漸下降，說(shuō)明細(xì)胞破碎已基本完成；同時(shí)也可能是黃酮隨時(shí)間被氧化所致.若再增加時(shí)間會(huì)加大成本，所以選時(shí)間為35min.

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響Fig.1Effect of ethanol volume fraction on the extraction rate of total flavones

圖2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2Effect of extraction time on the extraction rate of total flavones

圖3 料液比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3Effect of solid liquid ratio on the extraction rate of total flavones

2.3 料液比對(duì)馬齒莧總黃酮得率的影響

不同料液比對(duì)馬齒莧總黃酮得率的影響結(jié)果如圖3所示.從圖3可以看出，在料液比為1∶25時(shí)，總黃酮的得率達(dá)最大；料液比再減小，總黃酮得率略有下降.由物質(zhì)的溶解性可知，溶劑增多時(shí)，總黃酮的溶出率達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，黃酮的提取率變化不大，同時(shí)從經(jīng)濟(jì)利益出發(fā)，料液比選取1∶25較為適宜.

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化馬齒莧中總黃酮的提取條件

采用Box－Behnken進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)參數(shù)及結(jié)果見表2.從表2可以看出，以乙醇體積分?jǐn)?shù)Z1、提取時(shí)間Z2、料液比Z3為自變量，總黃酮得率Y為響應(yīng)值，采用Desinger Expert軟件對(duì)響應(yīng)面分析.響應(yīng)值Y與編碼（coded）自變量Z1，Z2，Z3擬合得到響應(yīng)面的二次方程為

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 2 Analysis methods and results of the response surface

表3 回歸模型方差分析及結(jié)果Table 3 Variance analysis and results for regression equation of model

2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

從表3可以看出，模型中一次項(xiàng)Z1，Z2，Z3極為顯著，二次項(xiàng)Z2Z3，Z22顯著，Z12，Z32極為顯著；整體模型的顯著水平P＜0.000 1，表明該模型極顯著.Pred（R2）為0.948 7而Adj（R2）是0.989 9，說(shuō)明擬合的模型方程較好，該模型可以用來(lái)指導(dǎo)實(shí)際實(shí)驗(yàn).

2.6 各因素相互作用對(duì)總黃酮得率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)Z1、提取時(shí)間Z2、料液比Z3三因素對(duì)提取率Y的響應(yīng)面圖如圖4所示.從響應(yīng)面3D圖的最高點(diǎn)和等值線可以看出，有極值存在于所選范圍內(nèi)，是響應(yīng)面的最高點(diǎn)，也是等值線最小橢圓的中心點(diǎn)；從響應(yīng)面圖的陡勢(shì)可以看出，提取時(shí)間與料液比相互作用的曲面變化顯著，即對(duì)總黃酮得率影響最大.

圖4 各因素對(duì)提取率的響應(yīng)面圖Fig.4The response surface plots of three effects on the extraction rate

2.7 條件優(yōu)化與驗(yàn)證

通過(guò)Design Expert軟件得到的最優(yōu)提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)83.46%，提取時(shí)間39.89min，料液比1∶25，理論得率為10.370 3mg／g.不足之處是所測(cè)的馬齒莧黃酮提取率較高，因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)采用乙醇為提取劑，乙醇的極性大，把葉綠素等成分提取了出來(lái)，這就造成所測(cè)吸光值較大，因此計(jì)算出的馬齒莧總黃酮得率偏大.

2.8 確定最佳提取工藝

通過(guò)Design Expert軟件得到的最佳提取工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)85%，提取時(shí)間40min，料液比1∶25，實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果為10.363 8mg／g，實(shí)際得率與理論得率相誤差為0.06%，二者極為接近.

3 結(jié) 論

（1）采用超聲－微波聯(lián)用法提取馬齒莧類黃酮，總黃酮得率有所提高.該方法具有高效、快捷、低耗能、小成本，對(duì)提取物活性成分影響小等特點(diǎn).

（2）文中所選的響應(yīng)面優(yōu)化手段較于其他方法具有可研究多因素間的交互作用，實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、周期短，所求得回歸方程精度高，分析結(jié)果更加清晰直觀等優(yōu)點(diǎn)，為今后天然活性物質(zhì)的提取提供一定的參考與指導(dǎo)作用，實(shí)用性較高.

（3）在3個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)中，以總黃酮得率為響應(yīng)值，運(yùn)用響應(yīng)面分析法得到最優(yōu)提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)85%，提取時(shí)間40min，料液比1∶25.

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編輯、校對(duì)：田莉

Optimization of ultrasonic－microwave extraction process of flavonoids from purslane by response surface methodology

CHEN Guoni，SUN Feilong，YAN Yaru，HOU Tiantian，WEN Gaigai

（School of Environmental ＆Chemical Engineering，Xi′an Polytechnic University，Xi′an 710048，China）

The response surface methodology was used according to the principle of central composite design on the basis of single factor test，and the optimum extraction process parameters were obtained by the software of Design Expert as follows：the ethanol volume fraction was 85%，the extracting time 40min，and the liquid solid ratio 1∶25.Under these conditions，the value of flavone extraction yield was 10.363 8mg／g，which approximates the predicted value 10.370 3mg／g.The results indicate that the response surface methodology can be used to optimize the ultrasonic－microwave assisted extraction process of flavonoids from purslane and the optimized extraction process parameters can be offered as a reference for industrial production of flavonoids from purslane.

purslane；flavonoids；ultrasonic－microwave assisted extraction；response surface methodology；extraction process

Q949.745.6；R284.2

A

1674－649X（2015）05－0555－06

10.13338／j.issn.1674－649x.2015.05.007

2015－01－06

陜西省教育廳科研計(jì)劃資助項(xiàng)目（15JK1315）

孫飛龍（1975—），男，山西省運(yùn)城市人，西安工程大學(xué)副教授，博士，研究方向?yàn)樘烊换钚晕镔|(zhì)的提取.E－mail：sunfeilong＠xpu.edu.cn