陳 麗， 余 涵， 周玉波， 馬 猛， 王林杰， 胡景鑫， 雷水生， 朱曉琴△

1廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院，廣州 5114362廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院皮膚美容科，廣州 510700

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乙酰唑胺對(duì)戊四氮致慢性癲癇大鼠海馬水通道蛋白4表達(dá)的影響*

陳 麗1， 余 涵1， 周玉波1， 馬 猛1， 王林杰1， 胡景鑫1， 雷水生2△， 朱曉琴1△

1廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院，廣州 5114362廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院皮膚美容科，廣州 510700

目的 觀察乙酰唑胺(acetazolamide，AZA)對(duì)戊四氮(pentylenetetrazole，PTZ)致慢性癲癇大鼠發(fā)作及海馬水通道蛋白4(aquaporin-4，AQP4)表達(dá)的影響，探討其抗癲癇的可能機(jī)制。方法 將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(每日腹腔注射生理鹽水)、致癇組[每日腹腔注射亞驚厥劑量PTZ 35 mg/(kg·d)建立慢性癲癇大鼠模型]、乙酰唑胺干預(yù)組[每日先腹腔注射AZA 35 mg/(kg·d)預(yù)處理，30 min后再腹腔注射亞驚厥劑量PTZ]和乙酰唑胺對(duì)照組[每日單純腹腔注射AZA]。各組采用以上注射方式連續(xù)給藥28 d，每次注射后1 h內(nèi)記錄各組大鼠癲癇發(fā)作級(jí)別，統(tǒng)計(jì)各組每天平均發(fā)作級(jí)別，觀察乙酰唑胺對(duì)大鼠慢性癲癇發(fā)作的影響；最后1次給藥1 d后，腦電圖記錄各組大鼠腦電的改變，免疫組化觀察AQP4在海馬內(nèi)分布，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot檢測(cè)AQP4 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果 對(duì)照組和乙酰唑胺對(duì)照組無(wú)明顯癲癇發(fā)作，乙酰唑胺干預(yù)組潛伏期為(23.5±2.4)d，而致癇組潛伏期為(18.2±1.7)d，乙酰唑胺干預(yù)可明顯延長(zhǎng)慢性癲癇大鼠點(diǎn)燃的潛伏期(P<0.05)；腦電圖結(jié)果對(duì)照組和乙酰唑胺對(duì)照組無(wú)明顯癇樣波，致癇組記錄到棘波、尖波等癇樣波，而乙酰唑胺干預(yù)組癇樣波明顯減弱；免疫組化結(jié)果顯示：AQP4主要分布在海馬CA3區(qū)血管周圍；RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示慢性致癇組AQP4 mRNA及蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05或P<0.01)，乙酰唑胺干預(yù)組AQP4表達(dá)降低但仍高于對(duì)照組(P<0.05)，乙酰唑胺對(duì)照組AQP4表達(dá)較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 乙酰唑胺能夠抑制癲癇的發(fā)作，延長(zhǎng)慢性點(diǎn)燃潛伏期，并且抑制AQP4的表達(dá)，其作用機(jī)制可能是與乙酰唑胺抑制AQP4表達(dá)，改善慢性癲癇狀態(tài)下腦內(nèi)水和離子平衡有關(guān)。

慢性癲癇； 水通道蛋白4； 乙酰唑胺； 戊四氮

癲癇是由多種病因引起神經(jīng)元突然的、短暫的、異常同步放電所致的腦功能紊亂。乙酰唑胺(acetazolamide，AZA)是碳酸酐酶抑制劑，目前臨床上用于治療癲癇和青光眼。然而乙酰唑胺抗癲癇作用機(jī)制還不是很清楚。水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)又稱作水孔蛋白，水通道蛋白4為腦內(nèi)主要水通道蛋白亞型，是最近發(fā)現(xiàn)的一種與水的通透性有關(guān)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并在各種原因產(chǎn)生的腦水腫中起重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)AQP4表達(dá)量在癲癇患者腦內(nèi)發(fā)生改變[2]，體內(nèi)外研究表明AQP4可能在癲癇發(fā)作中起關(guān)鍵作用[3]。最近研究發(fā)現(xiàn)乙酰唑胺可抑制AQP4的表達(dá)[4]。因此我們選擇乙酰唑胺進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)大鼠癲癇發(fā)作的影響以及對(duì)癲癇發(fā)作后AQP4表達(dá)水平的改變，以探討乙酰唑胺抗癲癇的可能機(jī)制，為乙酰唑胺作為AQP4抑制劑以及探索AQP4在癲癇發(fā)作過(guò)程中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

乙酰唑胺購(gòu)自Sigma公司；戊四氮(pentamethazol，PTZ)購(gòu)自Sigma公司；Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；引物合成由上海Invitrogen生物工程公司完成；RT-qPCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；AQP4兔抗大鼠單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；DAB購(gòu)自Bioword公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物分組

選用成年健康(Sprague-Dawley，SD)大鼠(廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重(240±40)g，雌雄不拘，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)條件下喂養(yǎng)。按實(shí)驗(yàn)要求隨機(jī)分為4組，①對(duì)照組(n=15)：腹腔注射生理鹽水；②致癇組(n=25)：腹腔注射亞驚厥劑量戊四氮；③乙酰唑胺干預(yù)組(n=25)：先腹腔注射乙酰唑胺，30 min后再腹腔注射亞驚厥劑量戊四氮；④乙酰唑胺對(duì)照組(n=15)：腹腔注射乙酰唑胺。

1.3 慢性動(dòng)物模型的建立

成年SD大鼠，腹腔注射亞驚厥劑量戊四氮35 mg/(kg·d)，連續(xù)注射28 d。每次注射后1 h內(nèi)觀察并記錄癇性發(fā)作潛伏期和發(fā)作強(qiáng)度。按Racine癲癇發(fā)作分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)[5]，0級(jí)：無(wú)發(fā)作反應(yīng)；Ⅰ級(jí)：口周及面部肌肉抽搐；Ⅱ級(jí)：點(diǎn)頭樣發(fā)作；Ⅲ級(jí)：前肢陣攣發(fā)作；Ⅳ級(jí)：直立，全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作；Ⅴ級(jí)：直立并摔倒，全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作伴失張力發(fā)作。其中，≤Ⅲ級(jí)的為輕度發(fā)作，Ⅳ級(jí)及以上的為重度發(fā)作，凡至少連續(xù)出現(xiàn)5 d Ⅱ級(jí)以上的發(fā)作即認(rèn)為慢性點(diǎn)燃成功[6]。

1.4 大鼠海馬腦電檢測(cè)

最后1次給藥1 d后，進(jìn)行腦電監(jiān)測(cè)。將各組動(dòng)物取俯臥位固定于立體定向儀(美國(guó)Stoelting公司)，根據(jù)諸葛啟釧的《大鼠腦立體定位圖》進(jìn)行海馬定位，于海馬深部前囟后3.0 mm，旁開2.5 mm，鉆開顱骨，挑開硬腦膜，用腦立體定位儀將腦電圖記錄電極送入硬膜下3.0 mm。將引導(dǎo)電極信號(hào)輸入BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄大鼠癲癇發(fā)作頻率。連續(xù)記錄1 h內(nèi)大鼠癲癇的放電頻率，以出現(xiàn)尖波、棘波為癲癇發(fā)作的腦電波。

1.5 免疫組化檢測(cè)海馬AQP4蛋白的表達(dá)及定位

冰凍包埋組織塊行30 μm厚連續(xù)切片，切片依次入(10%甲醇：0.3% H2O2)溶液30 min，正常山羊血清封閉液孵育2 h，兔抗大鼠AQP4一抗(1：500)4℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1：200)室溫孵育1 h，其間使用PBS充分洗滌。最后切片入DAB顯色液中顯色5～10 min，貼片，常規(guī)脫水透明封片。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)用PBS代替一抗。在同一光強(qiáng)度、放大倍數(shù)(×10、×40)下觀察。

1.6 RT-qPCR檢測(cè)AQP4 mRNA的表達(dá)

稱取50 mg海馬，溶于500 μL Trizol，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；β-actin的引物序列：上游5′-GGAGA-TTACTGCCCGGCTCCTA-3′，下游5′-GACTCA-TCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為150 bp。AQP4的引物序列：上游5′-TGCAGC-AGAGAGACATCAT-3′，下游5′-TGGAGACGT-CATCTGTGAGC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為185 bp。qPCR反應(yīng)條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用AQP4和β-actin RNA循環(huán)閾值(Ct)之差(ΔCt)計(jì)算得到相關(guān)基因的表達(dá)情況。計(jì)算對(duì)比的樣本間基因表達(dá)的差異(ΔΔCt)，表達(dá)差異的倍數(shù)RQ為2-ΔΔCt，以對(duì)照組的RQ值為1，各組是相對(duì)于1的變化倍數(shù)。

1.7 Western blot檢測(cè)AQP4蛋白的表達(dá)

取50 mg海馬組織加入蛋白裂解液，勻漿收集上清。蛋白定量后，以40 μg/孔上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE垂直電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后加入AQP4兔抗大鼠單克隆抗體(1：2 000)和β-actin兔抗大鼠單克隆抗體(1：2 000)4℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1：5 000)室溫孵育1 h，ECL顯色，利用Gene Gnome成像分析系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶。使用Image J軟件測(cè)定各條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化AQP4蛋白的表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)觀察

戊四氮注射后第1周首先出現(xiàn)外周膽堿能反應(yīng)，表現(xiàn)為全身顫抖、豎毛、嘴和面部肌肉抽搐(Ⅰ級(jí))，到第2周出現(xiàn)活動(dòng)減少、咀嚼、節(jié)律性點(diǎn)頭(Ⅱ級(jí))，隨后出現(xiàn)頭頸上仰、前肢陣攣發(fā)作(Ⅲ級(jí))，第3、4周部分大鼠明顯出現(xiàn)直立豎尾、以尾拍擊地面、全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作甚至直立并摔倒(Ⅳ、Ⅴ級(jí))；對(duì)照組和乙酰唑胺對(duì)照組未見癲癇發(fā)作，見圖1。第4周末戊四氮致癇組和乙酰唑胺干預(yù)組大鼠點(diǎn)燃率100%(25/25)。致癇組慢性點(diǎn)燃潛伏期為(18.2±1.7)d，乙酰唑胺干預(yù)組潛伏期為(23.5±2.4)d，乙酰唑胺干預(yù)組慢性點(diǎn)燃潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。

圖1 每天記錄各組大鼠給藥期間癲癇平均發(fā)作級(jí)別Fig.1 The average daily seizure severity in each group

2.2 腦電圖癇波改變

腦電圖結(jié)果顯示對(duì)照組和乙酰唑胺對(duì)照組無(wú)明顯癇樣波，為正常腦電圖波。致癇組記錄到棘波、尖波等癇樣波，而乙酰唑胺干預(yù)組癇樣波減弱或消失。各組大鼠海馬腦電圖記錄見圖2。

圖2 各組大鼠海馬腦電記錄圖Fig.2 The electroencephalogram(EEG) of rat hippocampus in each group

2.3 免疫組化檢測(cè)結(jié)果

免疫組化AQP4陽(yáng)性表達(dá)呈棕褐或棕黃色，可見AQP4主要分布在海馬CA3區(qū)血管周圍，結(jié)果見圖3。

2.4 RT-qPCR檢測(cè)海馬AQP4 mRNA表達(dá)

各組AQP4 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(1.000 0±0.000 1)、(3.965 0±0.367 7)、(1.930 7±0.231 4)、(0.321 0±0.315 4)。致癇組和乙酰唑胺干預(yù)組大鼠海馬中AQP4 mRNA的表達(dá)增加，高于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)，乙酰唑胺對(duì)照組表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)，乙酰唑胺干預(yù)組AQP4 mRNA表達(dá)低于致癇組(P<0.05)，結(jié)果見圖4。

A：10倍鏡下海馬CA3區(qū)觀察；B：40倍鏡下海馬CA3區(qū)觀察；箭頭示AQP4陽(yáng)性蛋白

A：對(duì)照組；B：致癇組；C：乙酰唑胺干預(yù)組；D：乙酰唑胺對(duì)照組；與對(duì)照組比較，*P<0.05 **P<0.01；與致癇組比較，#P<0.05

2.5 Western blot檢測(cè)海馬AQP4蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果見圖5，AQP4蛋白在對(duì)照組、致癇組、乙酰唑胺干預(yù)組及乙酰唑胺對(duì)照組表達(dá)相對(duì)灰度值比值分別為(0.349 9±0.042 5)，(0.576 1±0.037 5)，(0.462 5±0.026 0)，(0.219 0±0.013 7)。戊四氮致大鼠慢性癲癇后海馬AQP4蛋白表達(dá)明顯增高，致癇組和乙酰唑胺干預(yù)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，致癇組AQP4蛋白表達(dá)高于乙酰唑胺干預(yù)組(P<0.05)，乙酰唑胺對(duì)照組與對(duì)照組比較蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，結(jié)果見圖5。

3 討論

水通道蛋白(AQPs)是分布于水分代謝活躍細(xì)胞膜上，為主要介導(dǎo)水被動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的功能蛋白質(zhì)，對(duì)保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境水和電解質(zhì)的平衡起著非常重要的作用[7]。AQP4在正常腦組織中呈極性分布，主要位于血管周圍的星形細(xì)胞足突處，而靠近神經(jīng)元側(cè)足突表達(dá)較少[2]。近年研究表明，AQP4分布特點(diǎn)的維持與其錨定蛋白復(fù)合物相關(guān)，即抗肌萎縮蛋白復(fù)合物(dystrophin-associated proteins，DAPs)，其主要由肌聚糖、α-小肌營(yíng)養(yǎng)蛋白(α-dystrobrevin)和α-互養(yǎng)蛋白(α-syntrophin)等構(gòu)成[8]。

A：對(duì)照組；B：致癇組；C：乙酰唑胺干預(yù)組；D：乙酰唑胺對(duì)照組；與對(duì)照組比較，*P<0.05 **P<0.01；與致癇組比較，#P<0.05

戊四氮作為γ氨基丁酸(GABA)的拮抗物，通過(guò)阻止GABA自發(fā)釋放而致癇，戊四氮點(diǎn)燃的大鼠模型，其癇性發(fā)作形式、腦電圖變化和病理學(xué)改變與人類相似。本研究采用戊四氮化學(xué)點(diǎn)燃建立慢性大鼠癲癇模型，通過(guò)行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)符合慢性癲癇標(biāo)準(zhǔn)，大鼠慢性癲癇模型構(gòu)建成功。

AQP4主要位于圍繞在血管周圍的星形細(xì)胞足突處，這種分布模式有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞與血管間水的轉(zhuǎn)運(yùn)，本實(shí)驗(yàn)免疫組化檢測(cè)結(jié)果也顯示，AQP4主要表達(dá)在腦血管周圍。近年來(lái)AQP4與癲癇的關(guān)系已成為研究的熱點(diǎn)，Binder等[9-11]觀察AQP4敲除鼠和野生鼠對(duì)驚厥劑戊四氮的反應(yīng)性發(fā)現(xiàn)AQP4敲除鼠癲癇發(fā)作潛伏期延長(zhǎng)，體內(nèi)電刺激的方法記錄AQP4敲除鼠腦電發(fā)現(xiàn)癲癇誘發(fā)閾值和癲癇發(fā)作耐受能力明顯高于普通野生型小鼠。本實(shí)驗(yàn)?zāi)X電記錄也發(fā)現(xiàn)抑制AQP4表達(dá)能夠降低癇波發(fā)生。另外，在臨床研究中采用定量逆轉(zhuǎn)錄PCR對(duì)顳葉癲癇致海馬硬化患者手術(shù)所取海馬標(biāo)本的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AQP4 mRNA明顯增加[12]。在本實(shí)驗(yàn)中RT-qPCR和Western blot的結(jié)果均提示，慢性致癇組AQP4表達(dá)與對(duì)照組相比明顯增多，與上述研究結(jié)果一致。

研究已證實(shí)神經(jīng)元電活動(dòng)的穩(wěn)定性有賴于腦細(xì)胞外間隙(extracellular spaces，ECS)相對(duì)容積變化[13]。其主要原因是ECS內(nèi)包含大量離子、神經(jīng)遞質(zhì)如興奮性氨基酸和抑制性氨基酸等，構(gòu)成腦內(nèi)細(xì)胞興奮性活動(dòng)的微環(huán)境，因此ECS相對(duì)容積改變的同時(shí)，通常都伴隨著細(xì)胞外離子或神經(jīng)遞質(zhì)濃度改變進(jìn)而影響正常神經(jīng)元的電活動(dòng)。在神經(jīng)纖維網(wǎng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元與神經(jīng)元之間或神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間都存在特定的突觸聯(lián)系。研究表明使用低滲液在降低ECS相對(duì)容積的同時(shí)也增強(qiáng)了突觸間的聯(lián)系，提高了神經(jīng)元興奮性同步化頻率，增加癲癇活動(dòng)的發(fā)放，而高滲介質(zhì)則有相反的作用[14]。研究顯示AQP4表達(dá)增加以及分布極性改變是腦內(nèi)ECS改變的重要原因[15]。AQP4在血管側(cè)分布減少，而在神經(jīng)元側(cè)分布增加，這種極性改變影響了星形膠質(zhì)細(xì)胞將水分子及時(shí)排出到血管內(nèi)，結(jié)果過(guò)多的水分子滯留在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞腫脹，導(dǎo)致細(xì)胞外間隙容積減少，間接引起細(xì)胞外興奮性遞質(zhì)或K+濃度增加，另一方面腫脹的星形膠質(zhì)細(xì)胞還可通過(guò)容積敏感性陰離子通道(volume-regulated anion channels，VRACs)釋放興奮性氨基酸，從而增強(qiáng)該部位腦神經(jīng)元興奮性，引起癲癇發(fā)作[16]。

研究還發(fā)現(xiàn)AQP4和內(nèi)向整流鉀離子通道(inwardly rectify-ing potassium channel，Kir4.1)在星形膠質(zhì)細(xì)胞血管周圍足突上都呈現(xiàn)極性分布特點(diǎn)，而且在功能上相耦聯(lián)[17]。Amiry-Moghaddam等[18]發(fā)現(xiàn)，敲除α-syntrophin基因的小鼠驚厥易感性增加，并且海馬區(qū)域血管周圍AQP4顯著缺失，用微電極測(cè)量K+的清除率發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外K+清除時(shí)間明顯延長(zhǎng)，導(dǎo)致神經(jīng)元周圍K+濃度過(guò)高。

本研究中我們發(fā)現(xiàn)，致癇組與乙酰唑胺干預(yù)組點(diǎn)燃率無(wú)差別，在乙酰唑胺對(duì)照組中，乙酰唑胺能夠明顯抑制AQP4的表達(dá)，而在乙酰唑胺干預(yù)組其抑制效應(yīng)并不是很明顯。乙酰唑胺干預(yù)組RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示該組AQP4的表達(dá)依然高于正常組，說(shuō)明癲癇發(fā)作過(guò)程中還有其他因素調(diào)節(jié)AQP4表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)雙氯芬酸鈉能夠增強(qiáng)促炎因子上調(diào)星形膠質(zhì)膜上AQP4的表達(dá)[20]。Ito等[21]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)側(cè)腦室穿刺注射IL-1β后可引起AQP4的表達(dá)上調(diào)，也有研究顯示AQP4缺失可以明顯減輕脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)[22]。既往研究已證實(shí)，腦內(nèi)促炎癥因子失衡是癲癇發(fā)作的重要原因[23]，提示AQP4還可能通過(guò)與促炎因子相互作用促進(jìn)癲癇發(fā)作。但AQP4具體是通過(guò)何種作用機(jī)制來(lái)影響癲癇發(fā)作還需進(jìn)一步的研究。

[1] 崔向，寧尹嶺，王玉來(lái).水通道蛋白4在大鼠創(chuàng)傷性腦水腫中的作用機(jī)制[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2005，11(9)：719-721.

[2] Medici V，F(xiàn)rassoni C，Tassi L，et al.Aquaporin 4 expression in control and epileptic human cerebral cortex[J].Brain Res，2011，1367：330-339.

[3] Binder D K，Nagelhus E A，Ottersen O P.Aquaporin-4 and epilepsy[J].Glia，2012，60(8)：1203-1214.

[4] Sripathirathan K，Brown J R，Neafsey E J，et al.Linking binge alcohol-induced neurodamage to brain edema and potential aquaporin-4 upregulation：evidence in rat organotypic brain slice cultures andinvivo[J].J Neurotrauma，2009，26(2)：261-273.

[5] Mcnamara J O.Kindling：an animal model of complex partial epilepsy[J].Ann Neurol，1984，16 (Suppl)：S72-S76.

[6] Song M Y，Tian F F，Wang Y Z，et al.Potential roles of the RGMa-FAK-Ras pathway in hippocampal mossy fiber sprouting in the pentylenetetrazole kindling model[J].Mol Med Rep，2015，11(3)：1738-1744.

[7] Verkman A S.Knock-out models reveal new aquaporin functions[J].Handb Exp Pharmacol，2009，(190)：359-381.

[8] Amiry-Moghaddam M，F(xiàn)rydenlund D S，Ottersen O P.Anchoring of aquaporin-4 in brain：molecular mechanisms and implications for the physiology and pathophysiology of water transport[J].Neuroscience，2004，129(4)：999-1010.

[9] Binder D K，Oshio K，Ma T，et al.Increased seizure threshold in mice lacking aquaporin-4 water channels[J].Neuroreport，2004，15(2)：259-262.

[10] Binder D K，Yao X，Verkman A S，et al.Increased seizure duration in mice lacking aquaporin-4 water channels[J].Acta Neurochir Suppl，2006，96：389-392.

[11] Binder D K，Yao X，Zador Z，et al.Increased seizure duration and slowed potassium kinetics in mice lacking aquaporin-4 water channels[J].Glia，2006，53(6)：631-636.

[12] Lee T S，Eid T，Mane S，et al.Aquaporin-4 is increased in the sclerotic hippocampus in human temporal lobe epilepsy[J].Acta Neuropathol，2004，108(6)：493-502.

[13] Da T，Verkman A S.Aquaporin-4 gene disruption in mice protects against impaired retinal function and cell death after ischemia[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2004，45(12)：4477-4483.

[14] Traynelis S F，Dingledine R.Role of extracellular space in hyperosmotic suppression of potassium-induced electrographic seizures[J].J Neurophysiol，1989，61(5)：927-938.

[15] Binder D K，Papadopoulos M C，Haggie P M，et al.Invivomeasurement of brain extracellular space diffusion by cortical surface photobleaching[J].J Neurosci，2004，24(37)：8049-8056.

[16] Benfenati V，Caprini M，Nicchia G P，et al.Carbenoxolone inhibits volume-regulated anion conductance in cultured rat cortical astroglia[J].Channels(Austin)，2009，3(5)：323-336.

[17] Dibaj P，Kaiser M，Hirrlinger J，et al.Kir4.1 channels regulate swelling of astroglial processes in experimental spinal cord edema[J].J Neurochem，2007，103(6)：2620-2628.

[18] Amiry-Moghaddam M，Otsuka T，Hurn P D，et al.An alpha-syntrophin-dependent pool of AQP4 in astroglial end-feet confers bidirectional water flow between blood and brain[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(4)：2106-2111.

[19] Huber V J，Tsujita M，Kwee I L，et al.Inhibition of aquaporin 4 by antiepileptic drugs[J].Bioorg Med Chem，2009，17(1)：418-424.

[20] Asai H，Kakita H，Aoyama M，et al.Diclofenac enhances pr-oinflammatory cytokine-induced aquaporin-4 expression in cultured astrocyte[J].Cell Mol Neurobiol，2013，33(3)：393-400.

[21] Ito H，Yamamoto N，Arima H，et al.Interleukin-1 beta induces the expression of aquaporin-4 through a nuclear factor-kappaB pathway in rat astrocytes[J].J Neurochem，2006，99(1)：107-118.

[22] Li L，Zhang H，Varrin-Doyer M，et al.Proinflammatory role of aquaporin-4 in autoimmune neuroinflammation[J].FASEB J，2011，25(5)：1556-1566.

[23] 鄧鎮(zhèn)，羅淼珊，趙元淑，等.GluN2A 抑制劑對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠腦內(nèi)P-糖蛋白表達(dá)的影響[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2014，43(2)：168-172.

(2015-04-02 收稿)

Effect of Acetazolamide on the Expression of Aquaporin-4 in Hippocampus of Rats with PTZ-induced Chronic Epilepsy

Chen Li，Yu Han，Zhou Yuboetal

SchoolofBasicSciences，GuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou510182，China

Objective To observe the effect of acetazolamide(AZA)on pentylenetetrazole(PTZ)-induced chronic epileptic seizures in rats and aquaporin-4(AQP4)expression in hippocampus tissue of rats，and investigate the possible antiepileptic mechanism of AZA.Methods The experimental rats were randomly divided into four groups：control group，in which the rats were daily intraperitoneally injected with normal saline；epileptic group，in which the rats were daily administered a subconvulsive dose of PTZ(35 mg/kg)；AZA+PTZ group，in which the rats were daily treated with AZA(35 mg/kg)30 min before PTZ injection；AZA group，in which the rats were intraperitoneally injected with AZA(35 mg/kg)each day.All groups were administered for 28 consecutive days.The seizure severity of rats within one hour after each injection was recorded and the average daily seizure severity was obtained in each group to observe the effect of AZA on chronic epileptic seizures.One day after the last administration，the electroencephalogram changes of rats were recorded.Immunohistochemistry was used to detect the distribution of AQP4 in rat hippocampus.Real-time quantitative PCR(RT-qPCR)and Western blot were used to detect the expression of AQP4.Results Behavioral observation showed that rats in control group and AZA group had no obvious epileptic seizure.The average latent period was significantly increased in AZA+PTZ group(23.5±2.4)d compared with that in the PTZ group(18.2±1.7)d(P<0.05).AZA intervention could significantly prolong the latent period of chronic epilepsy.EEG showed no significant epileptic waves in the control group and the AZA group，but spike wave and sharp wave in the epileptic group.In the AZA+PTZ group，the number of epileptic waves was conspicuously reduced.Immunohistochemistry showed AQP4 was primarily localized surrounding brain capillaries in hippocampus CA3 region.The results of RT-qPCR and Western blot showed that the expression level of AQP4 mRNA and protein in hippocampus of PTZ group was increased obviously(P<0.05 orP<0.01).But the expression of AQP4 mRNA and protein in AZA+PTZ group was much lower than in PTZ group(P<0.05).The AQP4 mRNA and protein levels in AZA group were markedly reduced as compare with control group(P<0.05).Conclusion AZA can suppress the epileptic seizures and extend kindling latency.The antiepileptic mechanism of AZA may be associated with inhibition of AQP4 expression and maintenance of water and ion balance in the brain of rats with chronic epilepsy.

chronic epilepsy； aquaporin-4； acetazolamide； pentylenetetrazole

*廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2013J4100103)；廣州市屬高?？蒲杏?jì)劃項(xiàng)目(No.2012C128， 2012D001)；廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2013B021800191，2014A020212512)

R742.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2015.05.003

陳 麗，女，1990年生，碩士研究生，E-mail：chenli601793349@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：Leishuisheng@126.com(雷水生)；whzhuxiaoqin@163.com(朱曉琴)