劉慧，王群，王為木,*，談建康

1. 河海大學南方地區(qū)高效灌排與農業(yè)水土環(huán)境教育部重點實驗室，南京 210098 2. 河海大學水利水電學院，南京 210098 3. 南京市溧水區(qū)環(huán)境監(jiān)測站，南京 211200

兩種有機酸存在下銅對中華圓田螺肝臟的氧化應激效應

劉慧1,2，王群2，王為木1,2,*，談建康3

1. 河海大學南方地區(qū)高效灌排與農業(yè)水土環(huán)境教育部重點實驗室，南京 210098 2. 河海大學水利水電學院，南京 210098 3. 南京市溧水區(qū)環(huán)境監(jiān)測站，南京 211200

為探討不同水平EDTA和檸檬酸(CA)作用下沉積物中銅對底棲無脊椎動物生態(tài)毒理學效應，以中華圓田螺為受試生物，研究了肝臟中活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)以及過氧化氫酶(CAT)活性的變化規(guī)律。研究結果表明：有機酸存在下，銅污染底泥可誘導中華圓田螺肝臟產生ROS。電子順磁共振(EPR)技術得出的3組雙重峰分裂譜線為典型的α-苯基-N-叔丁基甲亞胺-N-氧化物(PBN)捕獲羥自由基(·OH)形成PBN/·OH的EPR波譜。有機酸存在下，低劑量銅(≤100 mg·kg-1)對MDA產量影響不顯著。較高劑量銅暴露下，EDTA的存在抑制MDA產生，CA的添加則均使MDA含量增加。EDTA存在下銅可顯著抑制中華圓田螺肝臟中SOD和CAT活性。相對而言，CA的加入可減緩高劑量銅暴露下中華圓田螺肝臟SOD與CAT酶活性的劇烈變化。

銅；有機酸；中華圓田螺；氧化應激；自由基；抗氧化系統(tǒng)

銅是水生動物的營養(yǎng)元素, 對生長發(fā)育相關的生物酶的組成和功能有著重要作用，但是過量的銅又會對生物體產生毒害。研究表明，螯合劑的加入可能改變金屬的生物可利用性，從而降低了其對水生生物的毒性。螯合劑包括：人工合成螯合劑，如乙二胺四乙酸(EDTA)；天然螯合劑，主要是低分子有機酸，來源于動植物殘體分解，植物根系分泌和微生物合成，如檸檬酸(CA)[1-4]。

當環(huán)境發(fā)生變化時，生物體能夠產生大量自由基，抗氧化酶活性也會發(fā)生相應的改變[5],很多環(huán)境毒理實驗都將其作為研究和評價污染物效應的重要標志物。中華圓田螺(Cipangopaludina cahayensis)具有高度靈敏度、分布廣泛、可控養(yǎng)性和底泥耐受性四大優(yōu)點，是理想的環(huán)境監(jiān)測生物[6]。

有機酸改善重金屬污染的研究大多集中于土壤[7]，而對沉積物中重金屬的研究則較少，也有學者選用腐殖酸對沉積物中重金屬進行研究[8]。而本文通過EDTA和CA對銅污染沉積物中中華圓田螺的毒性實驗，更進一步了解人工和天然有機酸對沉積物中銅污染環(huán)境下底棲生物的生態(tài)毒性效應。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

α-苯基-N-叔丁基甲亞胺-N-氧化物(PBN)購自Sigma公司，其余藥品均為國產分析純。

實驗沉積物取自河海大學江寧校區(qū)西湖沉積物。

中華圓田螺購自南京市水產養(yǎng)殖基地，平均質量為(31.35±3.56) g，長度為(53.82±3.01) mm，寬度為(35.91±5.57) mm。

1.2 方法

1.2.1 實驗設計

沉積物取自河海大學江寧校區(qū)西湖，風干后過150 μm孔徑尼龍篩，按土液質量比為1:1放入體積為36 L的魚缸(長×寬×高，45 cm×27 cm×30 cm)，土層厚度約20 cm。外源添加不同濃度的CuSO4·5H2O溶液，使沉積物銅污染程度分別達到國家土壤環(huán)境質量三級標準(Cu: 400 mg·kg-1)的0、0.125、0.25、0.5和1.0倍，即含銅量為0、50、100、200和400 mg·kg-1，各平行設置2個實驗組，以便添加不同有機酸。參照馮效毅等[9]和馬陶武等[10]的方法，培養(yǎng)銅污染底泥，間歇攪拌，至自然風干。分別在上述2個實驗組中按土液質量比1:1添加與Cu2+物質量比為1:1的EDTA、CA溶液，自然風干。添加除氯自來水，沉積物與上覆水的體積比為1:4，放入中華圓田螺，每天更新魚缸溶液50%。12 d后每個裝置取5只中華圓田螺，解剖，取出肝臟，測定活性氧(ROS)和生化指標。

1.2.2 自由基的捕獲和測定

自由基的捕獲與測定采用Davies改良方法。具體步驟為：活體解剖中華圓田螺，迅速稱取0.1 g肝臟，在N2氛圍中，置于已經加入1 mL以二甲基亞砜(DMSO)為溶劑，濃度為100 mmol·L-1的PBN溶液的玻璃勻漿器內，冰浴下勻漿，靜置，待勻漿液分層后，取上清液注入一端封口的毛細管中，迅速放入液氮中，待電子順磁共振(EPR)測定。

EPR(德國Bruker公司，Bruker EMX 10/12型EPR譜儀)操作參數：測試溫度130 K，微波功率20 mW，微波頻率9.751 GHz，調制頻率100 KHz，調制幅度0.5 G，中心磁場3 470 G，掃場時間84 s，時間常數41 ms，掃場寬度200 G，信號為5次疊加。

1.2.3 丙二醛(MDA)和蛋白含量，超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性的測定

MDA含量的測定：采用TBA比色法[11]。

蛋白含量的測定：用Bradford[12]的方法。

SOD活性的測定：采用改進后的鄰苯三酚法[13]。

CAT活性的測定：采用徐鏡波等[14]的方法。

1.2.4 數據處理與分析

實驗數據采用Origin 7.5和SPSS 17.0對數據進行統(tǒng)計分析，運用單因素方差分析方法，采用S-N-K檢驗法進行多重比較。差異顯著性水平為0.05，結果以標記字母法表示。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 有機酸存在下銅對中華圓田螺肝臟自由基的影響

DMSO在無氧情況下與羥自由基(·OH)生成甲基(·CH3)，有氧情況下生成甲氧基(·OCH3)，再被PBN捕獲形成穩(wěn)定的加合物。中華圓田螺肝臟捕獲的自由基超精細分裂常數PBN/·CH3為aN=14.3 G；aH=2.7 G；g=2.0059，PBN /·OCH3為aN=15.5 G；aH=3.3 G；g=2.0059，與文獻報道的PBN捕獲·CH3和·OCH3的特征參數基本一致[15]。因此，

可初步認定EDTA和CA存在下，沉積物銅污染可誘導中華圓田螺肝臟產生·OH。EPR自旋捕集技術直接證明了在有機酸存在的條件下，銅暴露誘導中華圓田螺肝臟產生ROS，其中CA存在下，暴露濃度為100 mg·kg-1時，中華圓田螺肝臟自由基圖譜如圖1所示。產生的自由基譜線為3組具有雙重超精細分裂譜線的6個峰，以第1組雙重峰的第1個超精細分裂峰的峰高的差值代表所產生的自由基信號強度，該濃度下信號強度為17 444.51。

中華圓田螺肝臟產生的羥自由基信號強度如圖2所示。EDTA和CA各處理組羥自由基信號強度均高于對照組。EDTA存在下，銅暴露濃度為50 mg·kg-1時，自由基信號強度與對照組無明顯差異，當濃度達到100 mg·kg-1以上時，可誘導羥自由基信號顯著增強，且隨濃度增高，自由基強度有降低趨勢。CA存在時，自由基信號強度均表現為顯著誘導，且隨暴露濃度的增大，自由基信號強度表現為先增大，再降低。

圖1 自由基圖譜Fig. 1 The EPR spectrum of free radical

圖2 有機酸存在下銅對中華圓田螺肝臟自由基信號強度的影響Fig. 2 Effects of copper on intensity of hydroxyl radicals signal in liver of C. cahayensis with the different levels of organic acids

2.2 有機酸存在下銅對中華圓田螺肝臟MDA含量的影響

MDA含量變化如圖3所示。有機酸存在時，較低濃度銅暴露均未引起MDA含量的顯著變化。400 mg·kg-1EDTA處理組顯著抑制了MDA含量；相反地，銅暴露濃度為200 mg·kg-1與400 mg·kg-1檸檬酸處理組，MDA含量顯著增加。

2.3 有機酸存在下銅對中華圓田螺肝臟SOD活性的影響

SOD活性變化情況如圖4所示。EDTA存在時，隨著銅暴露濃度的增大，SOD活性被顯著抑制，且隨暴露濃度升高抑制程度逐漸加大，暴露濃度為400 mg·kg-1時，SOD活性僅為對照組的3.39%。CA存在時，低濃度銅暴露會顯著抑制SOD活性，當銅暴露達到最高時，SOD活性反而出現被激活的趨勢。

2.4 有機酸存在下銅對中華圓田螺肝臟CAT活性的影響

CAT活性變化情況如圖5所示。EDTA存在時，各處理組CAT活性均表現為顯著抑制，銅暴露濃度達到400 mg·kg-1時，CAT活性達到最小值，為對照組的38.73%。CA存在下，銅抑制各處理組CAT活性。當銅暴露達到最高時，CAT活性有所增大。

3 討論(Discussion)

該實驗中，銅暴露情況下，有機酸的存在可誘導中華圓田螺肝臟產生·OH。其中低濃度EDTA處理組，中華圓田螺肝臟羥自由基未被顯著誘導。這表明EDTA對低濃度的銅污染具有解毒效應。有人研究了EDTA存在下銅對生物的毒性效應，得出EDTA可以降低銅的毒性[16-17]，這與本實驗得到的結果一致。魏克強等[18]研究Cu2+對克氏原螯蝦肝胰腺組織進行氧化損傷時，認為隨Cu2+濃度升高，ROS含量表現為先增大再降低；最大ROS含量顯著高于對照組。曹慧等[19]也認為鎘污染也會誘導黑斑蛙精巢產生ROS。這些結果說明，肝臟作為水生生物蓄積銅的主要組織，會誘導機體產生ROS，而ROS的產生可能就是銅污染致毒原因之一。暴露在重金屬環(huán)境下的生物會產生的ROS，當產生的ROS量大于清除能力時，機體就可能發(fā)生氧化應激[20]。

圖3 有機酸存在下銅對中華圓田螺肝臟MDA含量的影響Fig. 3 Effects of copper on malonaldehyde content in liver of C. cahayensis with the different levels of organic acids

圖4 有機酸存在下銅對中華圓田螺肝臟SOD活性的影響Fig. 4 Effects of copper on SOD activity in liver of C. cahayensis with the different levels of organic acids

圖5 有機酸存在下銅對中華圓田螺肝臟CAT活性的影響Fig. 5 Effects of copper on CAT activity in liver of C. Cahayensis with the different levels of organic acids

本實驗中，EDTA存在下，MDA含量隨銅暴露濃度的變化呈現出低劑量組增大、高劑量組降低的趨勢，與ROS變化規(guī)律一致。CA存在時，MDA含量在較高暴露濃度(>200 mg·kg-1)時被顯著誘導。羅義等[11]認為MDA含量的增加表明機體被污染物誘導，處于氧化應激狀態(tài)。紀靚靚等[21]研究2, 4, 6-TCP對鯽魚肝臟的氧化應激時得出·OH是引發(fā)脂質過氧化的主要自由基的結論，因此二者具有一致的變化趨勢。劉慧等[22]研究納米ZnO對鯽魚肝臟毒性時，也得出相同結果。

重金屬污染暴露下，SOD和CAT可共同起作用，清除生物體內因污染脅迫產生的活性氧自由基，導致水生生物SOD和CAT均被顯著抑制[20]。這與本實驗中EDTA存在下，銅對生物肝臟SOD和CAT活性效應一致。在CA存在下，高濃度銅暴露中華圓田螺肝臟CAT活性表現為誘導。這可能是由于CA的存在降低了銅的毒性效應，緩解了中華圓田螺肝臟抗氧化系統(tǒng)的劇烈變化。

綜上所述，銅污染沉積物中有機酸的存在均可誘導中華圓田螺肝臟產生ROS，ROS可能是銅污染致毒的原因之一，進而引起抗氧化系統(tǒng)組分變化的連鎖反應。相對而言，EDTA對低濃度的銅污染具有一定程度的解毒效應；而CA可有效地緩解高濃度銅污染下抗氧化系統(tǒng)的劇烈變化。因此，自然水體中存在的人工與天然有機酸均可影響重金屬污染對水生生物的生態(tài)毒性效應，但具體研究中還應考慮其他相關環(huán)境因素。

致謝：感謝南京大學現代分析測試中心眭云霞老師提供EPR測試以及有關EPR譜圖解析指導。

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◆

The Oxidative Stress of Copper on Liver of River SnailCipangopaludinacahayensisin the Presence of Two Kinds of Organic Acids

Liu Hui1,2, Wang Qun2, Wang Weimu1,2,*, Tan Jiankang3

1. Key Laboratory of High-Efficient Irrigation and Drainage and Agricultural Water and Soil Environment in Southern China, MOE, Nanjing 210098, China 2. College of Water Conservancy and Hydropower, Hohai University, Nanjing 210098, China 3. Lishui Environmental Monitoring Station, Nanjing 211200, China

16 August 2014 accepted 12 November 2014

The effects of EDTA or citric acid (CA) and copper in sediments on reactive oxygen species (ROS), malonaldehyde (MDA) content, superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities in liver of river snail, Cipangopaludina cahayensis were investigated to get insight into the ecotoxicological effects of copper in sediments with various gradient of EDTA or CA on benthic invertebrates. The results indicated that there was an obvious increase of ROS generation in liver of Cipangopaludina cahayensis treated with organic acids and copper compared with that of the control. The six-line composed of three groups with two hyperfine splitting peaks in each showed a typical hydroxyl free radicals (·OH) spectrum, using electron paramagnetic resonance (EPR) spin trapping technique, captured by α-phenyl-N-tert-butylnitron (PBN). At copper concentration of 100 mg·kg-1and below, the content of EDTA and CA had no significant effect on MDA. EDTA inhibited the generation of MDA at higher concentration of copper. On the contrary, CA induced the generation of MDA at higher concentration of copper. EDTA could suppress the SOD and CAT activities in liver of Cipangopaludina cahayensis after copper exposure. In contrast, the addition of CA could avoid the severe changes of SOD and CAT activities at the highest copper exposure.

copper; organic acid; Cipangopaludina cahayensis; oxidative stress; free radicals; antioxidant system

國家自然科學基金資助項目(51109060)；江蘇省環(huán)?？蒲匈Y助項目(2013057)

劉慧(1972-)，女，博士，研究方向為農業(yè)水土環(huán)境，E-mail: liuhui@hhu.edu.cn

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: wangwm@hhu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20140816001

2014-08-16 錄用日期：2014-11-12

1673-5897(2015)2-306-07

X171.5

A

王為木(1972-)，男，農業(yè)水土工程博士，副教授，主要從事土壤及水污染控制研究。

劉慧, 王群, 王為木, 等. 兩種有機酸存在下銅對中華圓田螺肝臟的氧化應激效應[J]. 生態(tài)毒理學報, 2015, 10(2): 306-312

Liu H, Wang Q, Wang W M, et al. The oxidative stress of copper on liver of river snail Cipangopaludina cahayensis in the presence of two kinds of organic acids [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 306-312 (in Chinese)