李修偉，校新蕾，梁亞萍，張春萍，張淑蘭，谷祖敏，祁之秋

沈陽農業(yè)大學植物保護學院，沈陽 110866

環(huán)境激素甲草胺對搖蚊谷胱甘肽硫轉移酶的抑制作用

李修偉*，校新蕾，梁亞萍，張春萍，張淑蘭，谷祖敏#，祁之秋

沈陽農業(yè)大學植物保護學院，沈陽 110866

谷胱甘肽硫轉移酶(GST)是生物體內重要的解毒酶。為研究環(huán)境激素甲草胺對溪流搖蚊GST的抑制作用及機理，采用酶標儀微量法測定甲草胺對溪流搖蚊4齡幼蟲GST的抑制活性及抑制類型。結果表明甲草胺在72 h活體染毒和離體狀態(tài)下均能顯著抑制溪流搖蚊GST的活性，且抑制程度隨著藥物濃度的增大而增大。甲草胺抑制GST活性的反應為可逆性抑制。進一步的酶動力學分析揭示甲草胺對GST的特異底物1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)和還原型谷胱甘肽(GSH)均表現為競爭性抑制，即甲草胺僅影響米氏常數(Km)，不改變酶促反應的最大反應速度(Vmax)。以上結果表明農藥殘留污染物甲草胺在脅迫下對搖蚊幼蟲GST酶活性會受到顯著影響，甲草胺對GST的抑制機制為可逆性和競爭性抑制。

甲草胺；溪流搖蚊；谷胱甘肽硫轉移酶；抑制機制

搖蚊是世界性分布的水生昆蟲，幾乎遍及所有的淡水生境，其分類上歸屬昆蟲綱，雙翅目，長角亞目，搖蚊科[1]。搖蚊幼蟲種類繁多，生物量約占底棲生物總量的70%～80%，是多種經濟魚類的優(yōu)良天然餌料，在生態(tài)系統(tǒng)中占據重要環(huán)節(jié)[2-3]。科研上常將搖蚊幼蟲作為水體環(huán)境污染生物監(jiān)測的重要指示生物[4-12]。

甲草胺是酰胺類選擇性芽前除草劑，由美國孟山都公司開發(fā)并于1969年商品化。主要用于一年生禾本科雜草及闊葉雜草的防除。其作用機制是通過內吸進入植物體內抑制蛋白酶的活性，使蛋白質無法合成，進而抑制細胞分裂，最終造成植物芽和根生長停止，無法形成不定根[13]。甲草胺是國際上應用最廣泛的除草劑之一，在美國，其2001年的年用量高達3 500 t左右[14]。我國20世紀70年代在黑龍江率先引進甲草胺，一度占據市場絕對優(yōu)勢份額。然而隨著乙草胺的國產化以及藥效、成本等因素影響，目前甲草胺已不再占據優(yōu)勢份額，僅在相應的應用范圍和地域擁有一定的市場[15]。截至2014年12月，在農業(yè)部農藥檢定所登記的甲草胺原藥產品有12種，單劑及復配制劑32種。每年的產量在1 000 t以上，僅占除草劑市場份額的3‰，主要用于防治春、夏大豆田、花生田、棉花田和玉米田等的雜草[16]。甲草胺在地表水和地下水及水體沉積物中均能不同程度的檢測到[17]，其在水體中的殘留量最高可達3 000 μg·L-1[18]；其中在水體沉積物中的殘留量可達183 μg·L-1。甲草胺在地表水中的半衰期約為30 d，在地下水的半衰期為808～1 508 d，在有氧土壤和缺氧土壤中的半衰期分別為20 d和5 d[15]。甲草胺是典型的環(huán)境激素類農藥，具有致畸及內分泌干擾活性，已被日本國立研究所列入具有內分泌干擾作用的黑名單[19]，美國規(guī)定其在飲用水的最低濃度值(MCL)為2 μg·L-1[20]。

谷胱甘肽硫轉移酶(GST)為生物體內重要的代謝酶系，通過谷胱甘肽的軛合作用參與生物體對外源物質的初級代謝和次級代謝。GST功能主要表現在以下3個方面：一是對異源有毒物質進行解毒代謝：GST可催化致癌劑、突變劑、農藥、藥物、抗生素物質等外源性化合物與還原型谷胱甘肽軛合，生成更易溶于水的物質代謝或分泌出體外，從而保護細胞免受這些物質的傷害，這是GSTs最基本的解毒和保護特性[21]。二是保護細胞免受氧化損傷，抑制微粒體過氧化反應，修復自由基引起的膜磷脂損傷，清除體內的過氧化氫物。三是對激素、內源代謝物和外源化合物進行細胞間運輸[22]。Ying等[23]的研究發(fā)現甲草胺可以顯著抑制搖蚊GST活性，Li等[24]的研究證實了這一現象并發(fā)現甲草胺可以誘導3個GST基因CtGSTd1，CtGSTs2和CtGSTs3上調表達。然而關于甲草胺影響GST的作用機理、抑制效應及酶促動力學等方面的研究較少。

溪流搖蚊(Chironomus riparius Meigen)是世界性分布的水生昆蟲，國內分布于天津、河北、浙江、海南、青海、遼寧等地[25]，其幼蟲具有體型小、世代周期短、易于養(yǎng)殖管理等優(yōu)點，在歐美國家已被作為生態(tài)毒理研究模式生物[12, 26]。以溪流搖蚊為供試對象，研究不同濃度甲草胺對活體和離體情況下GST活性的影響，系統(tǒng)測定甲草胺對搖蚊GST的抑制效應，抑制類型和酶促動力學參數的影響，以期從生物化學層面全面了解環(huán)境激素甲草胺對GSTs的抑制機理，為全面評價甲草胺對水生生物的生態(tài)毒理效應提供生化依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：SpectraMax 340多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)，CF16RXII型冷凍離心機(日本日立公司)，Potter-Elvehjem組織勻漿器(美國Sigma-Aldrich公司)。

試劑：2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉(BCA二鈉鹽)、無水碳酸鈉、酒石酸鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、硫酸銅、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、曲拉通-100(TritonX-100)、三羥甲基氨基甲烷、2,4-二硝基氯苯(CDNB)、牛血清蛋白、還原性谷胱甘肽(GSH)、無水乙醇、丙酮均為中國國藥集團化學試劑股份有限公司分析純試劑。甲草胺(分析標準品)購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 實驗材料

實驗用搖蚊采自于沈陽市沈河區(qū)滿堂河支流牤牛河河段(沈陽農業(yè)大學附近)，該河段污染來源主要是生活污水，河水經滿堂河污水處理廠處理凈化后達到GB18918—2002的一級B標準[27]；沉積物符合GB18918—2002的相應標準[28]。所采集搖蚊經鑒定為溪流搖蚊(Chironomus riparius)[29]。搖蚊帶回實驗室采用曝氣自來水于75 cm×45 cm×60 cm的玻璃缸內人工傳代飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件為(25±1) ℃，光照時間16 h/8 h(光/暗)。

1.3 實驗方法

1.3.1 染毒試驗、酶液制備及GST活性測定

挑取實驗室人工傳代飼養(yǎng)的，個體大小基本一致、健康的溪流搖蚊4齡初期幼蟲置于1 000 mL燒杯中，每燒杯10頭。參考Li等[24]的方法，各燒杯中分別加入100 μL含有不同量的甲草胺丙酮溶液，使得甲草胺濃度分別為1、10、100、1 000 μg·L-1，對照組添加100 μL丙酮。每處理重復3次。試蟲置于光照培養(yǎng)箱內72 h，溫度(25±1) ℃，光照時間16 h/8 h(光/暗)。72 h收集存活的搖蚊幼蟲用蒸餾水沖洗數遍，濾紙吸干后待用。

收集甲草胺處理后存活的試蟲分別放入預冷的組織勻漿器中，按每頭100 μL的比例加入預冷的0.1 mol·L-1含0.3% TritonX-100的磷酸緩沖液(pH 7.4)，研磨至無明顯肉眼可見的蟲體組織，勻漿后10 000 g離心10 min，上清液即為待測酶液。

參考Habig等[30]的方法測定72 h處理后甲草胺對搖蚊GST酶活的影響。取酶標板分別加入底物1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)和還原型谷胱甘肽(GSH)各100 μL并混勻，放入酶標儀內37 ℃孵育20 min，然后加入20 μL酶液，于340 nm處每隔1 min計數，共計數5 min，記錄其OD值，設3次重復并計算GST比活力(nmol·min-1·mg-1protein)，對照以20 μL磷酸緩沖液代替酶液。酶液蛋白質含量采用2,2’-聯(lián)喹啉4,4’-二羧酸二鈉(BCA)法測定[31]。依照以下公式計算酶活力：

GSTs活力單位(nmol·min-1)=(ΔOD340·υ)/(ε·L)

式中ΔOD340為吸光度每分鐘的變化值(ΔOD340·min-1)，υ為酶促反應體積(mL)，ε為產物的消光系數[0.0096L·(μmol·cm)-1]。

GSTs比活力[nmol·min-1·mg-1protein]=酶活力單位/酶液蛋白含量。

1.3.2 離體狀態(tài)下甲草胺對溪流搖蚊GST活性的影響測定

收集未染毒的健康溪流搖蚊4齡幼蟲采用1.3.1的方法制備酶液。分別將5 μL濃度為0(丙酮)、1、10、100、1 000 μg·L-1甲草胺丙酮溶液與100 μL CDNB和100 μL GSH混合。在酶標儀內37 ℃溫育20 min，然后加入20 μL酶液，采用1.3.1的方法測定酶活性，計算酶活力。

1.3.3 甲草胺對搖蚊GSTs抑制效應的測定

在GSTs活性測定體系中，固定底物CDNB，GSH的濃度，改變加入的酶液量，測定不同甲草胺濃度下酶活力隨底物濃度變化的規(guī)律，以加入酶液量對酶活力作圖，從而判斷化合物的抑制效應。

1.3.4 甲草胺對搖蚊GST抑制類型及抑制常數的測定

GST是雙底物酶，因此需要分別測定甲草胺對2種底物的抑制類型及抑制常數[32]，方法如下：在GST活性測定體系中，固定酶液和GSH的濃度，測定不同甲草胺濃度下酶活力隨底物CDNB濃度變化的規(guī)律；固定酶液和CDNB的濃度，測定不同甲草胺濃度下酶活力隨底物GSH濃度變化的規(guī)律。所得數據以Lineweaver-Burk雙倒數作圖，計算比較甲草胺對GST表觀米氏常數(Km)和最大反應速度(Vm)的影響。根據兩者的變化規(guī)律判斷抑制類型，計算抑制常數。

1.3.5 數據處理與分析

試驗結果采用Microsoft Excel 2003軟件計算平均數和標準差；所得數據采用PASW Statistics 18統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan法對均值進行多重比較，顯著水平為P<0.05；極顯著水平為P<0.01。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 甲草胺對溪流搖蚊GST活性的影響

甲草胺染毒72 h后溪流搖蚊4齡幼蟲GST活性變化如圖1所示。不同濃度甲草胺對溪流搖蚊4齡初期幼蟲GST活性具有顯著的影響，其活性在處理72 h后明顯被抑制(t檢驗，P<0.05)，且抑制程度隨著藥物濃度的增大而增大。與同期對照相比，濃度為10、100、1 000 μg·L-1的甲草胺處理后GST比活力分別被抑制1.32、1.57和1.94倍。

2.2 離體狀態(tài)下甲草胺對溪流搖蚊GST活性的影響

離體狀態(tài)下甲草胺對溪流搖蚊4齡幼蟲GST活性變化如圖2所示。與活體染毒試驗結果相類似，不同濃度甲草胺亦能抑制離體狀態(tài)下溪流搖蚊4齡初期幼蟲GST活性。在濃度為10、100、1 000 μg·L-1的甲草胺作用下，搖蚊GST比活力分別被抑制1.21、1.33和1.41倍。

2.3 甲草胺對溪流搖蚊GSTs抑制效應

GST經甲草胺作用后酶活力與酶液量之間的關系如圖3所示。酶活力對酶液量作圖得到一組通過原點的直線，且直線的斜率隨著甲草胺濃度的增大而降低。此結果表明甲草胺抑制GST活力的反應是可逆性抑制。此外，由圖3可以看出在同等酶液量下，酶活力隨甲草胺濃度的增加而降低，這與前述結果一致，進一步說明甲草胺能對溪流搖蚊GST產生抑制作用。

圖1 甲草胺對溪流搖蚊4齡期幼蟲GST酶活性的影響(72 h)Fig. 1 Effects of alachlor on GST activities in fourth-instar larvae of C. riparius (72 h)

圖2 離體狀態(tài)下甲草胺對溪流搖蚊4齡期幼蟲GST酶活性的影響Fig. 2 In vitro effects of alachlor on GST activities in fourth-instar larvae of C. riparius

圖3 甲草胺存在下溪流搖蚊GST酶活性與酶量的關系Fig. 3 Relationship between GST activity and enzyme content of C. riparius at different concentrations of alachlor

2.4 甲草胺對搖蚊GST抑制類型及抑制常數

2.4.1 以CDNB為底物時甲草胺對溪流搖蚊GST的抑制類型及抑制常數

表1 對CDNB，不同濃度甲草胺作用下溪流 搖蚊GST的Vmax和KmTable 1 Vmax and Km of GST at different concentrations of alachlor against CDNB

注：Vmax為反應最大速度；Km為米氏常數。

Note: Vmaxrepresents the maximum speed of reaction, and Kmrepresents the Michaelis constant.

對CDNB，甲草胺對溪流搖蚊GST抑制作用Lineweaver-Burk雙倒數圖，如圖4所示，為一組縱軸截距不變的直線，測定的數據(表1)表明甲草胺不改變酶促反應的最大反應速度(Vm)，只影響米氏常數(Km)，

其值隨著抑制劑濃度的增大而增大，其抑制機理表現為競爭性抑制[33]。運用二次作圖法以不同濃度甲草胺對酶抑制作用下測得的Km對甲草胺作圖，得到一條直線Y=0.0002X+0.1508，計算可知對CDNB，甲草胺對溪流搖蚊的抑制常數(KI)為754 μg·L-1。

2.4.2 以GSH為底物時甲草胺對搖蚊GSTs的抑制類型及抑制常數

對GSH，甲草胺對溪流搖蚊GST抑制作用Lineweaver-Burk雙倒數圖，如圖5所示，為一組縱軸截距不變的直線，測定的數據(表2)表明甲草胺不改變酶促反應的最大反應速度(Vm)，只影響米氏常數(Km)，其值隨著抑制劑濃度的增大而增大，其抑制機理表現為競爭性抑制。運用二次作圖法以不同濃度甲草胺對酶抑制作用下測得的Km對甲草胺作圖，得到一條直線Y=0.0002X+0.1081，計算可知對GSH，甲草胺對溪流搖蚊的抑制常數(KI)為540.5 μg·L-1。

表2 對GSH，不同濃度甲草胺作用下溪流 搖蚊GST的Vmax和KmTable 2 Vmax and Km of GST at different concentrations of alachlor against GSH

圖4 甲草胺抑制下底物CDNB濃度和溪流搖蚊GST活性的雙倒數圖Fig. 4 Lineweaver-Burk plots of CDNB concentration and GST activity under the inhibition of alachlor

對CDNB和GSH，甲草胺對溪流搖蚊GST的抑制作用均表現為可逆競爭性抑制作用，表明甲草胺既可以與CDNB競爭酶結合位點，又可以與GSH競爭酶結合位點，從而導致酶的活性喪失。

3 討論(Discussion)

甲草胺是水體常見的環(huán)境激素類農藥。已有的研究表明甲草胺具有肝臟毒性、腎毒性、內分泌干擾毒性等作用和潛在的致癌性，能對生物體造成生殖及發(fā)育缺陷[34]，因此相關研究的開展具有重要的意義。本研究顯示甲草胺在活體染毒和離體狀態(tài)下均能對溪流搖蚊GST產生顯著的抑制影響。這與Ying等[23]和Li等[24]在研究甲草胺污染對伸展搖蚊(Chironomus tentans)GST活性的影響所得出的結論一致。此外，甲草胺也能影響尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)多種組織GST活性[35]。持續(xù)低劑量暴露下甲草胺會對鯽魚肝臟谷胱甘肽(GSH)、激素代謝關鍵酶GST和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UDPGT)產生干擾[36]。這些結果表明甲草胺不僅僅影響多種雙翅目搖蚊科昆蟲的GST活性，也能影響其他水生生物的GST活性。

GST是生物體內重要的II相解毒酶，在生物體外源有毒物質代謝中和自由基清除中起到非常重要的作用。抑制GST的活性會降低搖蚊的解毒能力[37]，增加外源有毒物質的毒性。有研究表明甲草胺單獨作用下并不能對搖蚊產生顯著的毒性，但在聯(lián)合作用下會顯著增強毒死蜱對伸展搖蚊幼蟲的毒性[38]。進一步的生化酶活測定顯示這種增毒效應主要歸因于GST活性受到抑制。此外，搖蚊幼蟲生活的底棲環(huán)境含氧量相對較少導致其體內容易產生較多的自由基，這些自由基和水體沉積物中的重金屬沉積污染及水體中農藥殘留污染對搖蚊幼蟲生長發(fā)育造成不利影響。搖蚊GST活性受到抑制會降低其解毒能力及自由基清除作用，削弱搖蚊幼蟲在污染環(huán)境中的生存能力，最終影響到整個水生生態(tài)系統(tǒng)。

本文研究顯示甲草胺對GST的特異底物CDNB和GSH均表現為可逆性競爭抑制，對CDNB，甲草胺對溪流搖蚊的抑制常數(KI)為754 μg·L-1；對GSH，甲草胺對溪流搖蚊的抑制常數(KI)為540.5 μg·L-1。CDNB和GSH都是GST的經典底物，CDNB代表外源性有毒物質，而GSH為生物體內源性物質，兩者與GST結合部位不同，甲草胺與兩者具有相同的抑制作用說明甲草胺不僅僅與GSH競爭結合位點，也與CDNB競爭結合位點，從而導致酶活性的喪失。此外甲草胺對GSH的抑制常數低于對CDNB的抑制常數，說明甲草胺更易于與GSH競爭結合位點。同時正是由于對底物的競爭性抑制，甲草胺才可以對不同生物的GST造成類似的抑制作用。

本文以CDNB和GSH為底物，采用酶標儀微量法研究了甲草胺對溪流搖蚊GST的影響。結果顯示甲草胺在72 h活體染毒和離體狀態(tài)下均能顯著抑制溪流搖蚊GST的活性。酶動力學分析揭示甲草胺對GST的特異底物CDNB和GSH均表現為可逆性競爭抑制，且甲草胺更易于與GSH競爭結合位點。

致謝：感謝沈陽農業(yè)大學李彥博士在文章修改中給予的幫助。

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Inhibition Effect of Alachlor on GlutathioneS-transferase ofChironomusriparius(Diptera: Chironomidae)

Li Xiuwei*, Xiao Xinlei, Liang Yaping, Zhang Chunping, Zhang Shulan, Gu Zumin#, Qi Zhiqiu

College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China

19 November 2014 accepted 14 January 2015

Glutathione S-transferases (GST) is an important detoxification enzyme of the organisms. To investigate the inhibition effect and the mechanism of the environmental hormone pesticide alachlor against GST of Chironomus riparius, the inhibition activity and inhibition type of alachlor against fourth-instar larvae of C. riparius were determined by microtitration assay. The results showed that alachlor significantly inhibited GST activities both in vivo 72 h exposure and in vitro, and the inhibition degree increased in an alachlor concentration-dependent manner. The inhibition reaction of alachlor on GST was reversible. Further analysis of enzyme kinetics revealed that the inhibition was competitive with specific substrate of 1-chloro-2,4- dinitrobenzene (CDNB) and reduced Glutathione (GSH), that was to say that alachlor did not change the Vmvalue of enzymatic reaction, but affected the michaelis constant (Km). These results suggested that the GST activities of aquatic midge could be significantly affected by the pesticide residue of alachlor, while the inhibition mechanism of alachlor on GST was reversible and competitive.

alachlor; Chironomus riparius; glutathione S-transferase; inhibitory kinetics

國家自然科學基金(31101675)

李修偉(1978-)，男，博士，研究方向為毒理學，E-mail: xiuwei001@syau.edu.cn；

# 共同通訊作者(Co-corresponding author)， E-mail: guzumin1212@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20141119004

2014-11-19 錄用日期：2015-01-14

1673-5897(2015)2-243-08

X171.5

A

李修偉(1978—)，男，農藥學博士，講師，主要研究方向為天然產物農藥，農藥毒理學和生態(tài)毒理學，在國內外學術期刊發(fā)表學術論文10余篇。

谷祖敏(1973—)，女，農藥學博士，副教授，主要研究方向為微生物農藥，農藥環(huán)境毒理學，在國內外學術期刊發(fā)表學術論文30余篇。

李修偉, 校新蕾, 梁亞萍, 等. 環(huán)境激素甲草胺對搖蚊谷胱甘肽硫轉移酶的抑制作用[J]. 生態(tài)毒理學報, 2015, 10(2):243-250

Li X W, Xiao X L, Liang Y P, et al. Inhibition effect of alachlor on glutathione S-transferase of Chironomus riparius (Diptera: Chironomidae) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 243-250 (in Chinese)