徐明悅,李洪軍,王 珊,項 怡,員 璐,賀稚非

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400716)

食品中展青霉素檢測方法及脫除技術(shù)研究進(jìn)展

徐明悅,李洪軍,王 珊,項 怡,員 璐,賀稚非*

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400716)

展青霉素是由多種真菌產(chǎn)生的一種有毒代謝產(chǎn)物,廣泛存在于自然界中,易在水果及其制品中殘留,并可通過食物鏈進(jìn)行富集,嚴(yán)重威脅人類健康。本文對展青霉素的來源、性質(zhì)、檢測、脫除、存在問題及研究趨勢進(jìn)行概述,為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

展青霉素,檢測方法,脫除

近年來,真菌毒素污染食品事件時有發(fā)生。其中,展青霉素具有“三致”毒性,主要污染水果及其制品,并能通過食物鏈傳遞在生物體中蓄積。據(jù)報道,該毒素在世界范圍內(nèi)廣泛分布。Funes等[1]研究表明在阿根廷的蘋果和梨制品中,展青霉素的檢出率為21.6%(平均61.7μg/kg),蘋果醬中檢出率高達(dá)50%(平均123μg/kg);葡萄牙的嬰兒食品原料中展青霉素的檢出率高達(dá)7%,蘋果制品中檢出率高達(dá)23%[2];在中國東北市售的蘋果制品中僅12.6%的樣品中檢測不到展青霉素[3];Marín等[4]研究顯示西班牙市場中梨和蘋果濃縮汁中展青霉素的檢出量高達(dá)126μg/kg,遠(yuǎn)高于歐盟限量;突尼斯的果汁樣品和嬰兒食品樣品中展青霉素的檢出率分別為18%、28%[5]。目前,有關(guān)于展青霉素在食物中的檢測及脫除技術(shù)的研究較其他真菌毒素有所欠缺,且國內(nèi)對展青霉素的研究、存在問題和發(fā)展趨勢的系統(tǒng)性分析和總結(jié)的文章較少。本文通過對展青霉素相關(guān)的研究進(jìn)行綜述,為后續(xù)深入研究提供一定的理論基礎(chǔ)和實踐依據(jù)。

1 展青霉素概述

1.1 結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及來源

展青霉素,化學(xué)名稱為4-羥基-4-氫-呋喃-[3,2c]-吡喃-2(6)-酮,是由多種霉菌產(chǎn)生的一種非揮發(fā)性的水溶性多聚乙酰內(nèi)酯類真菌毒素[6-7],產(chǎn)生菌有青霉青霉、曲霉、絲衣霉等[8-9],其中擴(kuò)展青霉是主要產(chǎn)生菌[10],產(chǎn)毒菌株易在采摘、加工、貯運過程中污染蘋果、梨、山楂、草莓、桃、葡萄等及其制品[11-12]。

1.2 生物合成

展青霉素跟黃曲霉毒素、伏馬菌素等毒素一樣都是真菌通過聚酮代謝途徑產(chǎn)生的[13](如圖1),其編碼基因是在染色體上成簇存在的(PatA、PatB、PatC、PatD、PatE、PatF、PatG、PatH、PatI、PatJ、PatK、PatL、PatM、PatN、PatO)[14]。目前,PatK、PatH、PatI、PatN、PatE基因已被證實分別合成參與展青霉素產(chǎn)生過程中的限速酶 6-甲基水楊酸合酶、間甲酚甲基羥化酶、間羥基苯甲醇羥化酶、異環(huán)氧菌素脫氫酶和GMC氧化還原酶[15-17],其中m-cresol methyl hydroxylase、m-hydroxybenzyl alcohol hydroxylase是兩種細(xì)胞色素氧化酶P450類蛋白[17]?，F(xiàn)階段,對于展青霉素產(chǎn)生基因的研究較少,對于兩條產(chǎn)生途徑是否同時存在存在爭論,需要更多深入的研究。

圖1 展青霉素生物合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathway of Patulin

1.3 毒理作用

展青霉素具有廣泛的急性和慢性毒作用,主要表現(xiàn)在生殖毒性、遺傳毒性、免疫毒性、細(xì)胞毒性、致癌性等方面[18-27]。展青霉素能促進(jìn)谷胱甘肽與丁硫氨酸亞砜胺結(jié)合,誘導(dǎo)p53蛋白在細(xì)胞中累積,同時可能造成DNA分子交聯(lián)形成核質(zhì)橋,形成微核,造成細(xì)胞復(fù)制延遲,激活有絲分裂蛋白酶原,導(dǎo)致紡錘體加倍,進(jìn)而產(chǎn)生強(qiáng)烈的遺傳毒性[18-21]。Flávia等[22]證實小鼠經(jīng)腹腔注射2.5、3.75mg/kg的展青霉素,肝臟、腦、腎臟出現(xiàn)明顯的DNA損傷,并能顯著提高細(xì)胞的氧化活性。Dickens等[23]發(fā)現(xiàn)大白鼠皮下注射展青霉素后,注射部位誘發(fā)腫瘤,并相繼發(fā)現(xiàn)了致畸性和致突變性。Smith等[24]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)老鼠胚胎置于47～55μmol/L的展青霉素環(huán)境下,蛋白質(zhì)和DNA濃度等均有不同程度的下降;當(dāng)展青霉素濃度達(dá)62μmol/L時,胚胎40h內(nèi)死亡。此外,展青霉素能夠抑制白細(xì)胞的吞噬作用[25],改變結(jié)腸上皮細(xì)胞的膜電位和通透性[26],顯著提高睪丸酮和甲狀腺激素的含量[27]。

2 展青霉素殘留的檢測方法

2.1 預(yù)處理方法

預(yù)處理,是指從污染的食品中將待檢物質(zhì)提取、分離、純化的過程。由于展青霉素是非揮發(fā)性水溶性內(nèi)酯,酸性條件下穩(wěn)定,實驗室中通常采用乙酸乙酯、乙腈、水提取[3,28-29],使用液-液萃取、固相萃取、免疫親和柱等方法進(jìn)行純化[29-31]。

研究表明,液-液萃取技術(shù)[31]、雙溶劑微萃取(BS-DLLME)[44]、MycoSep 228 AflaPat多功能凈化柱[29]、將親水親油平衡柱(HLB)[8]、Oasis HLB固相萃取(SPE)小柱[30]、免疫親和柱[28]測得蘋果汁中展青霉素的回收率分別為94%～97%、91.3%～95.2%、86%～92%、90%、80.6%～91.8%、80.0%～101.1%。因此,雖然不同方法的原理不同,但是對于展青霉素純化的效果都是較理想的。

2.2 檢測技術(shù)

展青霉素的檢測技術(shù)大致可分為生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法、物理化學(xué)方法3大類,如表1所示。

目前,檢測食品中展青霉素的常用方法有HPLC、GC-MS、LC-MS等,但是由于其前處理繁瑣,儀器設(shè)備昂貴,需要建立專一性高、特異性強(qiáng)、價格低廉、快速檢測的技術(shù)。

2.2.1 聯(lián)用技術(shù) HPLC檢測展青霉素的技術(shù)已經(jīng)非常成熟,其前處理較其他色譜聯(lián)用技術(shù)簡單,準(zhǔn)確性較高,是目前最常用的檢測技術(shù)。隨著對檢測結(jié)果要求的提高,色譜聯(lián)用技術(shù)將得到廣泛的應(yīng)用。目前,常用的檢測展青霉素的聯(lián)用技術(shù)有氣質(zhì)聯(lián)用和液質(zhì)聯(lián)用,其中LC-MS被認(rèn)為是檢測霉菌毒素的最先進(jìn)的技術(shù)之一[43]。

據(jù)報道,Zhou等[44]研究使用PVPP-F和MycoSep 228凈化柱凈化蘋果汁后,用HPLC測定,效果較好,回收率分別為81.9%～100.9%和86.4%～103.9%,檢出限分別為3.99μg/kg和3.56μg/kg;采用BS-DLLME純化提取蘋果汁中的展青霉素,效果穩(wěn)定,回收率為91.3%～95.2%,HPLC測得展青霉素的檢出限低,為2.0μg/L[45],同時使用HPLC-DAD檢測展青霉素,回收率整體較BS-DLLME高,為94%～97%,檢出限較高為4.0μg/L[46];Beltrán等[47]使用UHPLC-MS聯(lián)用技術(shù),對比大氣壓化學(xué)電離源(APCI)和生物質(zhì)譜離子源(ESI)的檢測效果,得出此方法的回收率波動范圍較大,為71%～108%,此方法的檢出限受原料的影響較大,在水果、果脯、果醬、蘋果汁中的檢出限分別為2、3、2μg/L、0.015mg/kg;Marsol-Vall等[48]采用QuEChERS方法分離提取蘋果制品中的展青霉素,回收率為78.4%～94.7%,用UHPLC-PDA檢測出四個樣品中的最高含量為25.4ng/g,相對于其他方法而言此方法回收率波動較大,檢出限很高。

與液相色譜相比,氣相色譜檢測展青霉素前需將其衍生化,操作繁瑣,Llovera等[38]探索出不用衍生化而直接將展青霉素射到分析柱上,用MS檢測的方法,檢出限為4μg/L;Niloofar等[10]研究固相萃取后,使用N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺衍生展青霉素,再用GC-MS測得回收率79.9%～87.9%,檢出限為0.4μg/L;Llovera等[40]創(chuàng)立了氣相色譜-質(zhì)譜-選擇性離子監(jiān)測(GC-MS-SIM)檢測方法,該方法的檢出限為1μg/L。

表1 展青霉素常用檢測技術(shù)Table 1 Commonly used detection techniques for Patulin

綜上所述,研究者可以根據(jù)實驗要求和條件合理選擇物理化學(xué)檢測方法,同時探索和改進(jìn)檢測技術(shù)來滿足檢測的要求。

2.2.2 免疫技術(shù) 免疫技術(shù)以其專一性高、特異性強(qiáng)、檢測靈敏、快速、操作簡單等優(yōu)點,在檢測方面發(fā)展迅速,并被廣泛應(yīng)用,具有非常廣闊的發(fā)展前景。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)已經(jīng)逐漸發(fā)展成為檢測真菌毒素常用的方法。

展青霉素的免疫學(xué)檢測方法在快速分離和檢測上具有很高的研究價值。1993年,McElroy 等[41]首次制備出抗PAT-HG-BSA 的多克隆抗體(PcAb),建立了間接競爭ELISA 方法,并檢測了此PcAb的滴度及特異性;2006年鄧舜洲等[49]采用戊二酸酐法合成PAT-HG偶聯(lián)到BSA,成功制備出展青霉素免疫抗原(PAT-HG-BSA),免疫3只BALB/c小鼠,測得1號小鼠血清抗PAT 抗體效價達(dá)1∶1600,另外兩只為1∶200;2007年De Champdoré等[42]成功制備出一種高效價的抗展青霉素的多克隆抗體,并進(jìn)行熒光標(biāo)記,創(chuàng)建了競爭性熒光偏振免疫檢測方法,該方法檢測展青霉素的下限為10μg/L;2012年田園[50]按照McElroy提出的方法成功合成了特異性抗體,建立了直接ELISA方法,初步探索了展青霉素的免疫層析柱的制備。

Wang等[51]指出,免疫技術(shù)在對小分子真菌毒素的免疫分析中存在諸多缺點,如抗體制備繁瑣,假陽性檢出率較高等。由于展青霉素分子量小,是天然的半抗原,不能直接作為抗原使用,使得抗體制備繁瑣,且不穩(wěn)定,也為免疫檢測增加了難度。

3 脫除技術(shù)

3.1 原料污染控制及機(jī)理

由于展青霉素產(chǎn)生菌多侵染水果及其制品,所以從源頭控制展青霉素的產(chǎn)生尤為重要。近年來,對于展青霉素的拮抗菌的研究增多,據(jù)報道,黏紅酵母、羅倫隱球酵母、清酒假絲酵母、白隱球酵母、枯草芽孢桿菌均對展青霉素產(chǎn)生菌有拮抗作用[52-57]。拮抗菌的作用機(jī)理大致可以分為兩種:a.與展青霉素產(chǎn)生菌競爭養(yǎng)分和生存空間;b.分泌抗菌物質(zhì),合成抗菌蛋白[58-59]。此外,0.2%的植酸可增強(qiáng)膠紅酵母的抑菌作用[60],香菇培養(yǎng)液可增強(qiáng)羅倫隱球酵母抑制擴(kuò)展青霉生長的作用[52]。

3.2 產(chǎn)品中展青霉素的脫除

產(chǎn)品中展青霉素的常用的脫除技術(shù)主要分為物理法、化學(xué)法、生物法三大類,其原理及優(yōu)缺點如表2所示。

表2 展青霉素常用脫除技術(shù)Table 2 Commonly used removal techniques for Patulin

近年來,脫除技術(shù)的研究已經(jīng)從單一的物質(zhì)吸附向兩種或兩種以上物質(zhì)聯(lián)用的方向發(fā)展,如活性炭、酵母菌體分別與海藻酸鈉、明膠、磁性粒子等聯(lián)用制備固定化顆粒,既可脫除展青霉素又可保證食品的品質(zhì)。

目前,這種方法主要應(yīng)用于蘋果汁、獼猴桃汁中展青霉素的脫除。Yue等[68]研究發(fā)現(xiàn)活性炭含量為1%的海藻酸鈉-活性炭固定化顆?？梢悦摮O果汁中69.46%的展青霉素;Guo等[69]用堿處理廢棄啤酒酵母菌體,最高可吸附蘋果汁中58.29%的展青霉素,蘋果汁營養(yǎng)成分未受到較大的破壞,郭彩霞等[70]通過傅里葉近紅外光譜初步判斷,滅活酵母中起吸附作用的化學(xué)基團(tuán)主要是存在于細(xì)胞壁蛋白質(zhì)和糖類上的氨基、羧基和羥基;董媛等[71]比較了固定化失活酵母、磁性固定化失活酵母和失活酵母粉對蘋果汁中展青霉素的脫除效果,發(fā)現(xiàn)固定化失活酵母的吸附率高達(dá)70.4%,同時對蘋果汁品質(zhì)影響小。

4 展望

隨著研究的深入,已對展青霉素的毒性作用有了明確的認(rèn)識,但是對其產(chǎn)生、代謝機(jī)理和途徑有待于進(jìn)一步研究。因此,須依托于其他學(xué)科,深入研究其調(diào)控、產(chǎn)生機(jī)理,代謝速度及方式,降解方式及產(chǎn)物性質(zhì),為水果及其制品生產(chǎn)加工過程中的安全控制提供有力的理論依據(jù)。

展青霉素的檢測技術(shù)除運用理化方法外,還需要加強(qiáng)對免疫檢測方法的研究,開發(fā)免疫檢測與其他技術(shù)的聯(lián)用和混用的快速檢測技術(shù),建立更加快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確的檢測方法,以達(dá)到對大量樣品快速檢測的目的。

近年來,生物脫除技術(shù)因其成本低、安全性高、綠色環(huán)保、可行性強(qiáng)受到廣泛關(guān)注。已有微生物及菌體脫除展青霉素的報道,但是還處于實驗階段,且大多只是研究如何脫除,并未研究脫除后展青霉素是否變成其他有毒物質(zhì),造成二次污染的安全問題。未來應(yīng)重點研究:1)探索有效脫除展青霉素而又保持食品原有品質(zhì)的高效脫除技術(shù),加快新技術(shù)應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的進(jìn)程;2)通過基因工程改良拮抗菌種,應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中,實現(xiàn)真正意義上的綠色生物防治;3)研究展青霉素降解后產(chǎn)物的種類、檢測方法、安全性,為工業(yè)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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Research advances in detection and removal of Patulin in foods

XU Ming-yue,LI Hong-jun,WANG Shan,XIANG Yi,YUAN Lu,HE Zhi-fei*

(College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400716,China)

Patulin is a kind of mycotoxins produced by a variety of fungi. It is widespread in nature and it can be easily found in fruit and fruit products. Moreover,it results in serious threats to human health,by the enrichment in the organism and food chain. This paper summarized the origin,characteristics,detection,removal,current problems and future trends of patulin,which will provide a theoretical basis for follow-up study.

Patulin;detection;removal

2014-04-21

徐明悅(1989-)，女，碩士研究生，研究方向:食品微生物與發(fā)酵工程。

*通訊作者:賀稚非(1960-)，女，博士，教授，研究方向:食品微生物學(xué)與食品安全。

三峽庫區(qū)優(yōu)質(zhì)肉牛安全生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)集成與示范項目(2011BAD36B01)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)01-0375-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.071