陳紅英,李學(xué)剛,葉小利,徐建蓉

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽 621010;2. 西南大學(xué)藥學(xué)院黃連研究開發(fā)中心,重慶 400715)

黃連中阿魏酸對小檗堿在HepG2細(xì)胞中降糖活性的影響

陳紅英1,李學(xué)剛2,葉小利2,徐建蓉1

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽 621010;2. 西南大學(xué)藥學(xué)院黃連研究開發(fā)中心,重慶 400715)

為了考察黃連中酸性成分對小檗堿降糖作用的影響,用柱層析法分離鑒定酸性成分,以HepG2細(xì)胞建立高糖細(xì)胞模型,用MTT法測定細(xì)胞的生長,細(xì)胞消耗的葡萄糖用試劑盒檢測。結(jié)果從酸性組分中分離出阿魏酸,其結(jié)構(gòu)經(jīng)光譜與色譜確證。阿魏酸在高效液相色譜圖中有明顯的信號,與小檗堿在黃連浸膏中的質(zhì)量比約為32∶1。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,含小檗堿的培養(yǎng)液中加入阿魏酸后,細(xì)胞存活率和細(xì)胞消耗的葡萄糖明顯增加;在含36mg/L小檗堿的培養(yǎng)液中加入64mg/L阿魏酸,可使細(xì)胞的存活率上升到69%,細(xì)胞消耗的葡萄糖增加29.4%。此結(jié)果說明黃連中酸性成分阿魏酸能促進(jìn)小檗堿處理的HepG2細(xì)胞對葡萄糖的吸收生長,并降低小檗堿對HepG2細(xì)胞的毒性,顯示一定的協(xié)同增效作用。

黃連,阿魏酸,小檗堿,HepG2細(xì)胞,協(xié)同增效

黃連(CoptischinensisFranch.)為中國常見的一種中藥材,其化學(xué)成分有異喹啉生物堿小檗堿、黃連堿、巴馬汀、藥根堿及部分酸性成分阿魏酸、綠原酸等,其中小檗堿為主要化學(xué)成分,含量約10%[1]。黃連有降糖作用,在古今很多中藥降糖方劑均含有黃連[2-3]。普遍認(rèn)為,黃連降糖活性成分為小檗堿[4]。但有報(bào)道黃連浸膏或水煎液的降糖活性高于同等劑量的小檗堿[5]。事實(shí)上,黃連降糖方劑在臨床上也多以煎煮的方式用藥。在此過程中,除小檗堿外,其它成分也會溶出,其中部分酸性成分阿魏酸和綠原酸也有降糖作用的報(bào)道[6]。在臨床中藥的配伍中,對藥是中醫(yī)經(jīng)常使用的藥物,有很多酸堿對藥的配伍案例如大黃與附子、附子與甘草,甘草皂苷配伍小檗堿,麻黃和甘草,黃芩和黃連等[7]。為初步考察黃連中酸性組分對小檗堿降糖作用的影響,特別是其中高含量酸性成分的影響,酸性組分通過層析法被進(jìn)一步分離純化,酸性成分與小檗堿之間的相互作用用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人肝癌胚胎瘤細(xì)胞HepG2 購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心;黃連 重慶石柱黃連GAP種植基地,由西南大學(xué)藥學(xué)院袁呂江教授鑒定,樣品保存在西南大學(xué)黃連研究開發(fā)中心標(biāo)本館,樣品編號:20130317。

胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基 購自Gibco公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)和胰蛋白酶 購自Sigma公司;葡萄糖酶法測定試劑盒 購自南京建成生物工程研究所;鹽酸小檗堿、黃連堿、巴馬汀、表小檗堿、藥根堿、木蘭堿和反式阿魏酸對照品 購自成都曼斯特公司,純度均為98%;格蘭地新 自制,結(jié)構(gòu)已經(jīng)NMR、MS、IR確證;鹽酸二甲雙胍(純度98%) 購自南京澤朗植提;色譜甲醇、乙腈;其它試劑均為分析純。

LC-20A液相色譜儀、二極管陣列檢測器(DAD) 日本島津公司;Hypersil BDS C18色譜柱(5μm,4.6mm×250mm) 大連依利特科學(xué)儀器有限公司;Elix/Rios純水系統(tǒng)儀 Millipore公司;JJ-CJ-2F潔凈工作臺 蘇州市金凈凈化設(shè)備公司;ZEISSAxiovert40 CFL倒置顯微鏡 深圳九天實(shí)業(yè);AM-300M超導(dǎo)核磁共振儀 Bruker公司;Thermo 6500二氧化碳培養(yǎng)箱 上海旦鼎國際貿(mào)易公司;Eos BravoW全自動生化分析儀 上海安泰分析儀器廠;BioTek ELX800酶標(biāo)儀 上海天呈科技有限公司;超聲波清洗器 江蘇昆山。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酚酸性成分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定 黃連藥材5公斤粉粹后過20目篩,用3倍量70%乙醇浸泡三次,浸泡液合并濃縮至干得浸膏。浸膏用甲醇溶解后,用活性炭進(jìn)行吸附脫色。脫色液用聚酰胺柱層析,pH=4的冰醋酸水洗脫,分部收集洗脫液,TLC檢測。

1.2.2 HPLC分析

1.2.2.1 定性分析 流動相:乙腈-50mmol/L磷酸二氫鉀溶液(50∶50),其中含15mmol/L十二烷基磺酸鈉,磷酸調(diào)節(jié)pH為4.0;流速:1.0mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μL;檢測波長:254nm;標(biāo)準(zhǔn)溶液:表小檗堿,巴馬汀,藥根堿,黃連堿,木蘭堿,格蘭地新,分別配制成5mg/L的甲醇溶液;小檗堿,配成10mg/L的甲醇溶液;阿魏酸,配成100mg/L的甲醇溶液。

1.2.2.2 定量分析 酸性成分阿魏酸的含量測定:對照溶液的制備:稱取阿魏酸對照品20mg,精密稱定,用甲醇∶甲酸(5∶95)溶解并制成0.5mg/mL的儲備溶液。用時用70%甲醇稀釋成相應(yīng)的倍數(shù)。臨用前用0.45μm濾膜過濾。

樣品溶液的制備:取黃連藥材5g,粉碎后過20目篩,精密稱取0.2g,加入甲醇∶甲酸(5∶95)50mL,超聲加熱(70℃)提取30min,放冷,補(bǔ)足損失的甲醇,搖勻,取上清液過0.45μm濾膜,取續(xù)濾液2mL,用甲醇∶甲酸(5∶95)稀釋至10mL。

流動相由甲醇∶2%冰醋酸(20∶80)組成;流速為1mL/min;柱溫為30℃;檢測波長為322nm;HPLC-DAD在線收集紫外光譜的范圍為200～400nm;進(jìn)樣量為10μL。

黃連中小檗堿的含量測定:小檗堿對照溶液的制備:取鹽酸小檗堿對照品10mg,精密稱定,用甲醇溶解并定容至100mL,制成100mg/L的儲備溶液。臨用前用0.45μm濾膜過濾,取續(xù)濾液作為供試溶液。

小檗堿的含量測定方法按照中國藥典2010版第一部中黃連的含量測定方法進(jìn)行。

1.2.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)HepG2細(xì)胞,CO2濃度為5%,并保持飽和濕度。用0.25%的胰酶消化增殖狀況良好的細(xì)胞并進(jìn)行傳代。

1.2.3.2 樣品溶液制備 小檗堿、阿魏酸、MTT均用pH7的磷酸緩沖液配制,濾過除菌。使用時與不含血清的培養(yǎng)基按1∶9混溶。阿魏酸最終質(zhì)量濃度為2、4、8、16、32、64mg/L溶液。小檗堿濃度參考實(shí)驗(yàn)的半數(shù)抑制濃度,最終質(zhì)量濃度為1,36,72mg/L溶液。二甲雙胍最終質(zhì)量濃度為1mg/L溶液。

1.2.3.3 細(xì)胞降糖實(shí)驗(yàn) 將消化并稀釋好的HepG2細(xì)胞加入到96孔板中,按照文獻(xiàn)方法[8]建立高糖細(xì)胞模型,進(jìn)行體外降糖實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞鋪滿率達(dá)80%,每孔換用250μL含藥或不含藥的培養(yǎng)液。二甲雙胍作為陽性對照。對照組和實(shí)驗(yàn)組均重復(fù)三次。24h后利用酶法在505nm處用生化分析儀檢測培養(yǎng)液中葡萄糖剩余量。

1.2.3.4 MTT實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞降糖實(shí)驗(yàn)完成后,按照文獻(xiàn)方法[9],在HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)束時將待測培養(yǎng)液移出,換上含5mg/mL MTT的培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育4h,然后將培養(yǎng)液倒盡,吸干,每孔再加入200μL二甲亞砜,混勻后置酶標(biāo)儀上于490nm處測吸光度。吸光度值A(chǔ)與活細(xì)胞數(shù)成正比關(guān)系。細(xì)胞存活率計(jì)算公式為:

2 結(jié)果與討論

2.1 酚酸性成分的分離與鑒定

浸膏用活性炭脫色后,生物堿被吸附,得到酸性組分。酸性組分用聚酰胺柱層析后得到兩個化合物1(147mg),2(7mg)。它們的結(jié)構(gòu)鑒定分別為:

1,白色針晶,1HNMR(300Hz,CD3OD)δ:6.32(d,J=15.9Hz,H-2),7.52(d,J=15.9Hz,H-3),6.78(d,J=8.1Hz,H-3′),7.02(d,J=8.1Hz,H-4′),7.13(H-6′),3.81(s,-OCH3,);13CNMR(75MHz,CD3OD)δ:168.1(-COOH),149.2(C-2′),148.1(C-1′),144.6(C-3),125.9(C-5′),122.9(C-6′),115.8(C-2),115.7(C-3′),111.3(C-6′),55.8(-OCH3)。1HNMR與13CNMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]中反式阿魏酸的一致。

2,白色粉末,1HNMR(300Hz,CD3OD)δ:6.74(1H,d,J=7.5Hz,H-9),6.59(2H,s,H-8,H-3),4.10(1H,brd,J=12.9Hz,H-6a),3.83(3H,s,10-OCH3),3.81(3H,s,2-OCH3),3.59(1H,m,H-5),3.47(1H,m,H-5),3.32(3H,m,N-CH3),3.24(1H,m,H-4),3.08(1H,brd,J=11.7Hz,H-7),2.92(s,3H,N-CH3),2.78(1H,m,H-4),2.64(1H,brt,J=12.9Hz,H-7);13CNMR(CD3OD,75Hz):24.7(C-4),31.8(C-7),43.4(N-CH3),53.8(N-CH3),56.0(10-OCH3),56.3(2-OCH3),62.5(C-5),71.3(C-6a),109.4(C-3),110.5(C-9),115.8(C-3a),117.0(C-8),121.0(C-6b),123.5(C-11a),123.6(C-11b),126.0(C-7a),149.8(C-11),150.8(C-1),151.8(C-10),153.2(C-2)。1HNMR與13CNMR數(shù)據(jù)與木蘭堿[11]一致。

從酸性組分中得到大量阿魏酸,說明它在黃連中的含量較高。而木蘭堿從酸性組分中分離出,一方面其本身是多羥基生物堿,極性較大的原因,另一方面,可能活性炭對這種極性相對較強(qiáng)的阿樸菲型生物堿吸附力較弱。

2.2 HPLC分析與討論

2.2.1 定性分析 黃連的HPLC色譜圖見圖1,為了進(jìn)一步了解阿魏酸在黃連中的含量,在查閱文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)前期分離工作的基礎(chǔ)上,對黃連中主要生物堿及阿魏酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜分析,結(jié)果見圖1A。圖1B為樣品色譜圖。根據(jù)加樣回收實(shí)驗(yàn)及每個信號的色譜行為,5個主要色譜峰分別判定為5個異喹啉型生物堿小檗堿、表小檗堿、藥根堿、黃連堿、巴馬汀(圖1中1～5號峰);6、7號峰為酚性生物堿格蘭地新和木蘭堿。8號峰與標(biāo)準(zhǔn)反式阿魏酸的紫外及保留時間一致,加樣實(shí)驗(yàn)的色譜行為也一致,判定為阿魏酸。色譜圖中的8個色譜峰基本上得到了指認(rèn)。其中7個生物堿的色譜峰及紫外吸收均較強(qiáng),而阿魏酸的相關(guān)信號在樣品色譜圖中則相對弱得多。雖然文獻(xiàn)報(bào)道黃連中還含有綠原酸,但與標(biāo)準(zhǔn)綠原酸色譜圖比對,發(fā)現(xiàn)在相應(yīng)的位置并無信號,可能原因與綠原酸含量少或在相應(yīng)色譜條件下保留時間短有關(guān)。

圖1 對照溶液(A)和黃連浸膏(B)的HPLCFig.1 HPLC of contrast solution and Coptis chinensis Franch.extracts注:1:小檗堿;2:巴馬汀;3:黃連堿;4:表小檗堿; 5:藥根堿;6:格蘭地新;7:木蘭堿;8:阿魏酸。

2.2.2 定量分析 為考慮阿魏酸對小檗堿細(xì)胞降糖的影響,分別測定了黃連中阿魏酸及小檗堿的含量。阿魏酸HPLC分析結(jié)果見圖2。在實(shí)驗(yàn)條件下,阿魏酸峰形對稱,塔板數(shù)為3750,分離度較好。外標(biāo)法測得黃連中阿魏酸的含量為0.25±0.033mg/g;以峰面積對進(jìn)樣濃度進(jìn)行線性回歸,線性方程為y=3750 x+174500(R2=0.9764),在2.2～13.1mg/L內(nèi)具有良好線性關(guān)系。樣品的平均回收率為97%±2.35%。保留時間RSD均小于0.5%,色譜峰的峰面積RSD均小于1.5%。樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。目前尚無黃連中阿魏酸含量的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

因阿魏酸溶液易氧化,隨著光照時間及存放時間的延長,反式阿魏酸變?yōu)轫樖桨⑽核岬膸茁试龈摺悠啡芤旱纳V圖(圖2)中1號峰后的小峰經(jīng)二級陣列管檢測器檢測,與順式阿魏酸的紫外圖譜一致,兩峰的峰面積之比約為16∶1。進(jìn)行阿魏酸含量測定時,樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液須現(xiàn)配現(xiàn)用。另一方面,阿魏酸在極性太小和太大的溶劑中均不易溶出。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)原料用甲醇∶甲酸(5∶95)超聲加熱(70℃)提取30min后,殘?jiān)袔缀鯔z測不出阿魏酸。在色譜分離條件下,黃連中存在的生物堿基本上不被洗脫,而保留在色譜柱上,因此,它們對阿魏酸的測定影響較小。

圖2 阿魏酸含量測定的HPLC圖Fig.2 HPLC of ferulic acid reference standard(C) and extracts of Coptis chinensis Franch(D)注:C:樣品溶液;D:對照溶液;1:反式阿魏酸的色譜峰。

小檗堿HPLC圖見圖3。按照2010版中國藥典標(biāo)準(zhǔn)測定,石柱黃連中小檗堿的含量為7.91±0.022mg/g,與文獻(xiàn)報(bào)道[12]一致。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果測得黃連中阿魏酸的含量為0.25±0.033mg/g,由此說明黃連浸膏中小檗堿與阿魏酸的質(zhì)量比約為32∶1。

圖3 小檗堿含量測定的HPLC圖Fig.3 HPLC of berberine reference standard(E) and extracts of Coptis chinensis Franch.(F)注:E:樣品溶液;F:對照溶液;2:小檗堿的色譜峰。

2.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.3.1 阿魏酸對小檗堿處理的肝細(xì)胞增殖作用的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。結(jié)果表明,在一定濃度下,阿魏酸本身有微弱的促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖作用,而小檗堿有一定的細(xì)胞毒性。這與文獻(xiàn)報(bào)道[13-14]一致。在實(shí)驗(yàn)中,用不同濃度小檗堿處理HepG2細(xì)胞后,計(jì)算其半數(shù)抑制率為36mg/L。在36mg/L的小檗堿溶液中混合加入0 ～64mg/L的低濃度阿魏酸后,HepG2細(xì)胞的存活率明顯上升,效果非常顯著。當(dāng)含64mg/L阿魏酸后,存活率上升到69%。

小檗堿引起肝細(xì)胞凋亡的機(jī)理可能與其能引起細(xì)胞信號分子ASK1,AKT,MAPKs變化,從而導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生有關(guān)[15]。雖有報(bào)道高劑量的阿魏酸對HepG2細(xì)胞的生長有一定的抑制作用,其凋亡機(jī)理可能與此細(xì)胞中NADPH氧化酶系統(tǒng)激活產(chǎn)生的ROS有緊密聯(lián)系[16],但低劑量0 ～64mg/L的阿魏酸對HepG2細(xì)胞的影響很小。Sudheer等[17]發(fā)現(xiàn)10 ～300μmol/L(相當(dāng)于1.94 ～60mg/L)阿魏酸對3μmol/L尼古丁所誘導(dǎo)的大鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷及細(xì)胞改變有顯著的保護(hù)效應(yīng)。該研究認(rèn)為尼古丁引起內(nèi)源性抗氧化因子,如SOD、CAT、GSH-Px等的減少,而加入阿魏酸治療后這種趨勢得到抑制。小檗堿處理的HepG2細(xì)胞中加入阿魏酸后,細(xì)胞存活率提高是否也與抗氧化因子有關(guān)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖4 阿魏酸與小檗堿混合對HepG2細(xì)胞增值作用的影響Fig.4 cytotoxity effect of berberine in combination with ferulic acid on HepG2 cells注±s,n=4;小檗堿同一濃度下 a-g表示組內(nèi)差異顯著,p<0.05。

2.3.2 阿魏酸對小檗堿處理的細(xì)胞吸收葡萄糖的影響 小檗堿能促進(jìn)細(xì)胞吸收葡萄糖,但阿魏酸對其降糖作用的影響鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選用阿魏酸來考察此影響,一方面中藥配伍中有酸堿藥對配伍的模式,另一方面阿魏酸有一定降糖效果[18],常有與它藥聯(lián)用用于糖尿病并發(fā)癥治療的報(bào)道[19-20]。近年來也發(fā)現(xiàn)它對某些降糖藥物有協(xié)同增效的作用[21]。從圖5中可看出,在同一濃度下,阿魏酸促進(jìn)肝細(xì)胞吸收葡萄糖的效果不如二甲雙胍和小檗堿。在小檗堿的三個不同濃度中加入阿魏酸后,細(xì)胞吸收葡萄糖的前后效果有顯著差異(p<0.05),呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。36mg/L的小檗堿與阿魏酸的組合明顯優(yōu)于另兩個濃度1mg/L和72mg/L。當(dāng)在含有36mg/L小檗堿的培養(yǎng)液中加入64mg/L阿魏酸后,葡萄糖消耗量增加29.4%。隨著阿魏酸加入量的增加,葡萄糖消耗增加量先快后慢。結(jié)果表明,二者合用后,能明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖,并能促進(jìn)細(xì)胞吸收葡萄糖,體現(xiàn)了一定的協(xié)同增效。

小檗堿能促進(jìn)肝細(xì)胞吸收葡萄糖可能與其抑制細(xì)胞線粒體功能,導(dǎo)致肝中糖原異生和脂肪積累受阻有關(guān)[22]。閆忠卿等認(rèn)為小檗堿可使HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗量增加69.11%,小檗堿能通過肝細(xì)胞發(fā)揮顯著的降糖作用可能與其調(diào)節(jié)肝細(xì)胞核因子4的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)GK活性有關(guān)。也有報(bào)道認(rèn)為小檗堿降糖與下調(diào)HepG2細(xì)胞HNFs mRNA表達(dá),調(diào)節(jié)肝臟葡萄糖代謝相關(guān)激酶活性有關(guān)[23]。阿魏酸這種行為機(jī)理目前不是很明確。阿魏酸為藥用植物當(dāng)歸、川芎及很多中藥方劑中單一的主要藥效成份,臨床研究證實(shí)其具有十分廣泛的治療作用(如抗炎、抗糖尿病、抗癌、抗衰老、抗細(xì)胞凋亡)和眾多的靶器官保護(hù)作用(如肝、肺、神經(jīng)及抗輻射保護(hù))。阿魏酸的降糖作用與其能改善胰島素抵抗有關(guān)[24]。目前,相關(guān)合成藥物阿魏酸鈉片、阿魏酸哌嗪片早已用于臨床心腦血管疾病治療。高利臣等發(fā)現(xiàn)一定濃度范圍內(nèi)阿魏酸顯著增加了藥物代謝酶及轉(zhuǎn)運(yùn)體活性CYP3A4、2C9、2B6、MDR及MRP2-ER-8啟動子活性,顯示了對藥物代謝酶及轉(zhuǎn)運(yùn)體體外誘導(dǎo)活性[25]。文獻(xiàn)報(bào)道[26]阿魏酸、小檗堿在肌小管細(xì)胞中有不同的降糖機(jī)制。

圖5 阿魏酸與小檗堿混合 對促進(jìn)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗作用的影響Fig.5 Glucose-lowering effect of berberine in combination with ferulic acid on HepG2 cells注±s,n=4;小檗堿同一濃度下 a-g表示組內(nèi)差異顯著,p<0.05。

3 結(jié)論

用柱層析法從黃連的酸性組分中分離出阿魏酸。酸性成分阿魏酸與黃連主要降糖活性成分小檗堿都有不同程度的促進(jìn)HepG2細(xì)胞吸收葡萄糖的作用。二者按照不同比例混合后,顯示一定的協(xié)同增效作用,阿魏酸能促進(jìn)小檗堿的細(xì)胞降糖作用,并在一定程度上減弱小檗堿的細(xì)胞毒性。當(dāng)在含36mg/L小檗堿的培養(yǎng)液中下加入64mg/L阿魏酸后,可使HepG2細(xì)胞的存活率上升到69%,細(xì)胞消耗的葡萄糖增加29.4%。

HPLC結(jié)果表明,阿魏酸與小檗堿在黃連中的近似質(zhì)量比約為32∶1。由此推測,黃連中酸性成分阿魏酸一方面能減弱小檗堿對肝細(xì)胞的細(xì)胞毒性,另一方面也能在一定程度上促進(jìn)含小檗堿的培養(yǎng)液中肝細(xì)胞對葡萄糖的吸收,二者對肝細(xì)胞的葡萄糖消耗呈現(xiàn)一定的協(xié)同增效作用。黃連中阿魏酸對小檗堿降糖作用的影響還需動物實(shí)驗(yàn)及進(jìn)一步的分子機(jī)制研究,同時,黃連中其它酸性成分是否對小檗堿降糖作用產(chǎn)生影響也需進(jìn)一步的探討。

[1] 匡艷輝,朱晶晶,王智民,等. 一測多評法測定黃連中小檗堿,巴馬汀,黃連堿,表小檗堿,藥根堿含量[J]. 中國藥學(xué)雜志,2009(5):390-394.

[2]劉繼林,孟憲麗,劉詠松. 古代中醫(yī)用黃連治療消渴的方藥探討[J]. 四川中醫(yī),2010,28(4):41-43.

[3]馬燕,袁月新,張俊梅,等. 黃連相關(guān)中藥復(fù)方治療糖尿病及其并發(fā)癥的研究概況[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(12):272-275.

[4] 李彩虹,周克元. 黃連活性成分的作用及機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 時珍國醫(yī)國藥,2010,21(2):466-468.

[5]喬琳琳,黃飛,閆小光,等. 黃連煎劑對代謝綜合征大鼠模型骨骼肌 AMPK 表達(dá)的影響[J]. 中華中醫(yī)藥雜志,2010(1):145-148.

[6]吳衛(wèi)華,康楨,歐陽冬生,等. 綠原酸的藥理學(xué)研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2006,18(4):691-694.

[7]裴妙榮,段秀俊,裴香萍,等. 中醫(yī)方劑中酸堿對藥的配伍化學(xué)研究[J]. 中國中藥雜志,2009(15):1989-1993.

[8]殷峻，胡仁明，唐金鳳，等.小檗堿的體外降糖作用[J].上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，21(5)：425-427

[9]殷峻,胡仁明. 小檗堿,齊墩果酸和大蒜新素對糖代謝作用的體外研究[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2003,26(2):36-38

[10]Jiang W,Wang C H,Wang Z T. Water-soluble chemical constituents of Angelica Sinensis(Oliv.) Diels[J]. Chin Pharm J,2010,45(2):101-103.

[11]Jung H A,Yoon N Y,Bae H J,etal. Inhibitory activities of the alkaloids from Coptidis Rhizoma against aldose reductase[J]. Archives of pharmacal research,2008,31(11):1405-1412.

[12]黃小平,張毅,鐘國躍. 不同產(chǎn)地和生長年限黃連的總生

物堿含量測定[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2004,18(1):42-43.

[13]Chen H Y,Ye X L,Cui X L,etal. Cytotoxicity and antihyperglycemic effect of minor constituents from Rhizoma Coptis in HepG2 cells[J]. Fitoterapia,2012,83(1):67-73.

[14]Ma B L,Ma Y M,Shi R,etal. Identification of the toxic constituents in Rhizoma Coptidis [J]. Journal of ethnopharmacology,2010,128(2):357-364.

[15]Hyun M S,Hur J M,Mun Y J,etal. BBR induces apoptosis in HepG2 cell through an Akt‐ASK1‐ROS‐p38MAPKs‐linked cascade[J]. Journal of cellular biochemistry,2010,109(2):329-338.

[16]Lee YS. Role of NADPH oxidase-mediated generation of reactive oxygen species in them echanism of apoptosis induced by phenolic acids inHepG2 human hepatoma cells[J]. Arch Ph arm R es,2005,28(10):1183 - 1189.

[17]Sudheer A R,Muthukumaran S,Kalpana C,etal. Protective effect of ferulic acid on nicotine-induced DNA damage and cellular changes in cultured rat peripheral blood lymphocytes:A comparison with N-acetylcysteine[J]. Toxicology in vitro,2007,21(4):576-585.

[18]Choi R,Kim B H,Naowaboot J,etal. Effects of ferulic acid on diabetic nephropathy in a rat model of type 2 diabetes[J]. Experimental & molecular medicine,2011,43(12):676-683.

[19]龐彩云. 前列地爾聯(lián)合阿魏酸鈉治療糖尿病腎病的臨床觀察[J]. 中國實(shí)用醫(yī)刊,2011,38(3):27-28.

[20]藺樞勇,吳瑞格,周蕾. 阿魏酸鈉聯(lián)合低分子肝素鈣治療糖尿病腎病蛋白尿 20 例[J]. 中國藥業(yè),2012,21(Z1):144-145.

[21]Prabhakar P K,Prasad R,Ali S,etal. Synergistic interaction of ferulic acid with commercial hypoglycemic drugs in streptozotocin induced diabetic rats[J]. Phytomedicine,2013,20(6):488-494.

[22]Xia X,Yan J,Shen Y,etal. Berberine improves glucose metabolism in diabetic rats by inhibition of hepatic gluconeogenesis[J]. PLoS one,2011,6(2):e16556.

[23]劉鋒,冷三華,陸付耳,等. 小檗堿對 HepG2 細(xì)胞肝細(xì)胞核因子基因表達(dá)的影響[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2007,15(3):141-144.

[24]劉志霞,韓淑英,李繼安. 人肝癌細(xì)胞胰島素抵抗模型建立及有效中藥成分的篩選[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15(28):5241-5244.

[25]高利臣. 阿魏酸對藥物代謝酶,轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的影響及其與 CYP2B6,POR 和 PXR 基因多態(tài)性關(guān)系[D]. 長沙:中南大學(xué),2012.

[26]Prabhakar P K,Doble M. Synergistic effect of phytochemicals in combination with hypoglycemic drugs on glucose uptake in myotubes[J]. Phytomedicine,2009,16(12):1119-1126.

Effect of ferulic acid fromCoptischinensisFranch on hypoglycemic acitivity of berberine in HepG2 cells

CHEN Hong-ying1,LI Xue-gang2,YE Xiao-li2,XU Jian-rong1

(1. College of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China;2. College of Pharmaceutical Sciences,Southwest University,Chongqing 400715,China)

In order to study impact of acidic component fromCoptidisRhizomaon glucose-lowering effect of berberine in HepG2 cells,acidic constituents were separated fromCoptidisRhizomaextracts by column chromatography,and cell assay was performed by MTT and Kit methods in high glucose model. From acidic constituents,ferulic acid was separated and identified by chromatography and spectrum methods. It had obvious peak signal in HPLC. Quantitative determination of ferulic and berberine was finished by HPCL-DAD. Their weight ratio inCoptidisRhizomaextracts was approximately 32∶1. Cell experiment showed that berberine 36mg·L-1in combination with ferulic acid 64mg·L-1could make glucose consumption increase by 29.4% and elevate cell livability up to 69% in HepG2 cells,compared with same dose of berberine. The result suggested that ferulic acid,had some synergistic effect on improving glucose-lowering effect of berberine and decreasing cytotoxicity of berberine in HepG2 cells.

CoptischinensisFranch;ferulic acid;berberine;HepG2 cells;synergistic effect

2014-04-08

陳紅英(1973-),女,博士,主要從事藥品食品檢測及天然產(chǎn)物化學(xué)方向的教學(xué)及科研工作。

西南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)室開放基金(13xnkf10);西南科技大學(xué)博士基金(13zx7118)。

TS201

A

1002-0306(2015)01-0361-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.068