蔡佳佳，劉振珂，李吉華，李自發(fā)，徐凱勇，徐凌川

山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355

大鯢肉對D-半乳糖誘發(fā)小鼠衰老相關(guān)指標(biāo)的影響*

蔡佳佳，劉振珂，李吉華，李自發(fā)，徐凱勇，徐凌川△

山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355

目的：探討大鯢肉對D-半乳糖衰老模型小鼠的抗衰老作用和可能的作用機(jī)制。方法：將KM小鼠72只隨機(jī)分為空白對照組、衰老模型組、陽性對照(Vit E)組和大鯢肉低、中、高劑量組，每組12只。除空白對照組外，其他各組均以D-半乳糖誘發(fā)亞急性衰老小鼠模型方法造模，腹腔注射D-半乳糖水溶液125 mg／(kg·d)；空白對照組注射同體積注射用水，持續(xù)7周；大鯢低、中、高劑量組小鼠分別自由采食16、32、48 mg／(g·d)大鯢肉質(zhì)，陽性對照組灌胃100 mg／(kg·d)Vit E水溶液，空白對照組灌胃同體積注射用水，持續(xù)8周。8周后觀察大鯢肉對衰老模型小鼠行為學(xué)及基本體征的影響，并檢測小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量及端粒酶（TE）活性。結(jié)果：與空白對照組相比，衰老模型組小鼠體質(zhì)量增加明顯減少，血清SOD和端粒酶活性降低、MDA含量增加(P＜0.01)；與模型組相比，大鯢肉各劑量組小鼠體質(zhì)量增加升高，血清SOD活性升高，MDA含量減少(P＜0.05)；大鯢肉低、中劑量組小鼠血清端粒酶活性有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；大鯢肉高劑量組及VE組小鼠血清端粒酶活性明顯升高(P＜0.05)。結(jié)論：大鯢肉對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型小鼠有抗衰老作用，其機(jī)制可能與提高小鼠血清SOD、端粒酶活性，減少M(fèi)DA含量有關(guān)。

衰老模型；小鼠；大鯢；D-半乳糖；體質(zhì)量；超氧化物歧化酶；丙二醛；端粒酶

中國大鯢（Andrias davidianus）簡稱大鯢，俗名娃娃魚、人魚、孩兒魚，兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科、大鯢屬，是中國特有的珍稀大型兩棲動物[1]，被譽(yù)為“水中人參”[2]。中醫(yī)認(rèn)為，大鯢性甘淡，能截瘧，具有滋陰補(bǔ)腎、補(bǔ)血行氣的功效[3]。

以往的研究多集中于養(yǎng)殖、形態(tài)、分布等方面，對大鯢藥理學(xué)的研究報(bào)道較少。本研究針對衰老的氧化損傷學(xué)說和端粒學(xué)說，采用D-半乳糖亞急性衰老小鼠模型[4]，以維生素E(V it E)[5]作為陽性對照，觀察大鯢肉對小鼠基本體征及行為學(xué)的影響，研究其抗衰老作用；并觀察其對小鼠血清超氧化物歧化酶(S OD)和端粒酶活性以及對丙二醛(MDA)含量的影響，初步探討大鯢肉抗氧化、抗衰老的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 受試動物為S P F級KM小鼠，體質(zhì)量25～28 g，雌雄各半，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：S C X K(魯) 20110003，使用許可證號：S YX K(魯)20110019。

1.2 藥品與試劑 大鯢由浙江舟山惠和堂生物科技有限公司提供，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)徐凌川教授鑒定。D-半乳糖(南京生興生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)批號7H307H C O)；維生素E粉末（購于嘉興天和誠生物科技有限公司，生產(chǎn)批號20130308004）；端粒酶檢測試劑盒(生產(chǎn)批號201304)、S OD檢測試劑盒(型號：A001-1，生產(chǎn)批號20130510)、MDA檢測試劑盒 (型號：A003-1，生產(chǎn)批號20130509)均購于南京建成生物工程研究所，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器 C O2培養(yǎng)箱（Shanghai Lishen S c ienti f i c E q u i p ment C O.，L td）；52A型醫(yī)用低速離心機(jī)（安新縣白洋離心機(jī)廠）；電熱恒溫水浴鍋（北京醫(yī)療設(shè)備廠有限公司）；洗板機(jī)（ELX50，BI O-T E K In s t r u ment.I N C）；酶標(biāo)儀（ELX808IUU it ra M i cro p late R ead）；電子分析天平(BS2105，北京賽多利斯天平有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組與處理 將KM小鼠72只隨機(jī)分為空白對照組、衰老模型組、陽性對照(V it E)組和大鯢肉低、中、高劑量組，每組12只。除空白對照組外，其他各組均按文獻(xiàn)記載采用D-半乳糖誘發(fā)亞急性衰老小鼠模型方法[3]造模，腹腔注射D-半乳糖水溶液125m g／(k g·d)，空白對照組注射同體積注射用水，持續(xù)7周；大鯢低、中、高劑量組小鼠分別自由采食16、32、48m g／(g·d)大鯢肉質(zhì)；陽性對照組灌胃100m g／(k g·d)V it E水溶液；空白對照組灌胃同體積的注射用水，持續(xù)8周。8周后，摘眼球取血處死小鼠，分離血清，取上清液待測。

1.4.2 小鼠一般行為學(xué)觀察及體征記錄 實(shí)驗(yàn)期間每天觀察小鼠一般行為改變，包括進(jìn)食、活動、毛色改變等情況，每5天稱小鼠體質(zhì)量，觀察各組小鼠體質(zhì)量變化情況。

1.4.3 SOD、TE活性測定和MDA含量測定 實(shí)驗(yàn)動物摘眼球取血（不少于0.5 m L），血液室溫自然凝固（20～30 min），3 000 r/min離心15 min，分離血清置-20℃凍存。取血清分別測定MDA含量(硫代巴比妥酸T B A法)、S OD活性(黃嘌呤氧化酶法)和T E活性（酶聯(lián)免疫分析EL IS A法），操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，于酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度(A)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用S P SS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多組間均數(shù)兩兩比較采用S N K-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)指標(biāo)觀察結(jié)果 造模前各組動物反應(yīng)良好，毛發(fā)光滑，飲食正常，行動敏捷。與空白對照組相比，造模后2周起衰老模型組小鼠相繼出現(xiàn)不同程度進(jìn)食減少、倦怠少動、反應(yīng)遲緩、嗜睡、毛發(fā)干枯稀疏發(fā)黃缺乏光澤現(xiàn)象。大鯢肉各劑量組和VE組上述改變均不同程度得到緩解。

2.2 小鼠體質(zhì)量變化結(jié)果 體質(zhì)量變化差異在造模后3周出現(xiàn)并逐漸擴(kuò)大，各組小鼠8周后體質(zhì)量變化差異顯著，實(shí)驗(yàn)期間衰老模型組小鼠體質(zhì)量增加較正常組明顯降低，大鯢肉各劑量組和V it E組體質(zhì)量增加均大于衰老模型組（P＜0.01），見表1。

表1 大鯢肉對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠體質(zhì)量的影響（±s）

表1 大鯢肉對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠體質(zhì)量的影響（±s）

注：與空白對照組比較，△表示P＜0.01；與衰老模型組比較，*表示P＜0.01；與VE組比較，#表示P＜0.05。

6.8±1.13 1.6±1.26△4.8±1.13*2.6±1.96*4.6±2.05*6.5±1.35*#組別 劑量（mg/kg） 實(shí)驗(yàn)前/g 實(shí)驗(yàn)3周后體質(zhì)量/g 實(shí)驗(yàn)8周后體質(zhì)量/g空白對照組衰老模型組Vit E組大鯢肉低劑量組大鯢肉中劑量組大鯢肉高劑量組--100 0.016 0.032 0.048 26.8±0.48 27.7±0.12 26.4±0.22 27.7±0.28 26.5±1.01 27.1±0.13 32.8±0.24 29.3±1.17 31.2±1.92 29.3±2.63 31.1±2.12 33.6±0.44

2.3 小鼠血清SOD、MDA及端粒酶活性的檢測結(jié)果 與空白對照組比較，模型組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)變化顯著，血清中S OD活性降低、MDA含量增加（P＜0.01）；與衰老模型組相比，大鯢肉各劑量組和V it E組小鼠S OD活性均有明顯提高、MDA含量均有不同程度下降，且符合量效關(guān)系；其中大鯢肉高劑量組數(shù)據(jù)相較其他實(shí)驗(yàn)組在S OD活性、MDA含量方面變化更為顯著（P＜0.05）。

對小鼠血清端粒酶活性的影響方面，大鯢肉低、中劑量組小鼠血清端粒酶活性有升高趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；大鯢肉高劑量組及V it E組小鼠血清端粒酶活性明顯升高（P＜0.05），作用具有一致性，見表2。

表2 大鯢肉對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠SOD活性、端粒酶活性及MDA含量的影響（±s）

表2 大鯢肉對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠SOD活性、端粒酶活性及MDA含量的影響（±s）

注：與空白對照組比較，△表示P＜0.01；與衰老模型組比較，**表示P＜0.01,*表示P＜0.05；與VitE組比較，#表示P＜0.05。

3 討論

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為動物藥屬“血肉有情之品”，許多動物藥療效確實(shí),歷史悠久,然而對其有關(guān)化學(xué)研究方面的記載較少。大鯢是中國特有的一種珍稀大型兩棲動物,是傳統(tǒng)名貴藥用動物，也是一種食用價(jià)值極高的經(jīng)濟(jì)動物[6]。陶弘景首次將大鯢列為藥用動物，明代《本草綱目》將大鯢歸為鱗部，無鱗魚類，記載其有滋陰補(bǔ)腎，補(bǔ)血行氣之功效。食用鯢肉可強(qiáng)壯體質(zhì)，有效防治貧血、月經(jīng)失調(diào)等癥，對防止心血管疾病、貧血和腫瘤有一定的作用[1]。但近年應(yīng)用整體衰老動物模型研究大鯢肉抗衰老作用少見報(bào)道。

衰老是生物體在生命周期中隨著年齡增長而發(fā)生的全身各組織器官功能衰退和穩(wěn)態(tài)功能下降的過程,是機(jī)體各種生化反應(yīng)的綜合表現(xiàn)[7]。在衰老與抗衰老研究中，D-半乳糖誘導(dǎo)亞急性衰老模型以其自身的諸多優(yōu)勢如實(shí)驗(yàn)周期短、個(gè)體差異小、重現(xiàn)性穩(wěn)定、方法可靠[4]，成為國內(nèi)常用的衰老相關(guān)研究的動物模型。

依據(jù)自由基學(xué)說，衰老與自由基引起的生物膜脂質(zhì)過氧化密切相關(guān)[7-9]。S OD是機(jī)體防御體系中能夠清除體內(nèi)氧化物自由基的關(guān)鍵酶，反映機(jī)體清除自由基、保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷的能力。MDA是機(jī)體在氧自由基作用下生成的脂質(zhì)過氧化物，其水平可反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。因此，本研究初步確立以S OD活性、MDA含量的指標(biāo)變化進(jìn)行大鯢肉抗氧化的研究。

本研究顯示，衰老模型組在連續(xù)注射D-半乳糖7周后，小鼠體質(zhì)量增加緩慢、活動能力降低，體內(nèi)S OD活性降低、MDA含量升高。采食大鯢肉能夠明顯改善以上情況，增加D-半乳糖致衰老小鼠的體質(zhì)量，同時(shí)，血清檢測發(fā)現(xiàn)，大鯢肉治療組小鼠S OD活性明顯增強(qiáng)，MDA含量明顯降低，提示其可能通過直接清除體內(nèi)氧自由基和激活抗氧化防御系統(tǒng)等作用提高機(jī)體的抗氧化能力，減少自由基對機(jī)體的損傷，從而起到延緩衰老的作用。同時(shí)，高劑量組的作用最為明顯,說明其促進(jìn)機(jī)體抗自由基損傷的作用可隨劑量增加而增強(qiáng)。

端粒及端粒酶很可能是抗衰老藥物作用的靶點(diǎn)[10]，研究表明，V it E作為自由基清除劑，其抗衰老作用與端粒酶作用于細(xì)胞生長、發(fā)育和凋亡等過程密切相關(guān)[11]。本研究顯示，大鯢肉高劑量對D-半乳糖衰老模型小鼠血清端粒酶活性的作用效果與V it E有一致性，對小鼠端粒酶活性有明顯提高作用，提示激活部分組織細(xì)胞的端粒酶活性，延緩端粒縮短可能是其抗衰老作用的機(jī)制之一。

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EffectsofGiantSalam anderM eaton Physiological IndexesofD-galactose Induced Aging M iceModels

CAIJiajia,LIU Zhenke,LIJihua,LIZifa,XU Kaiyong,XU Lingchuan△
Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China

Objective:To explore anti-aging effectsof giantsalamander（Andrias davidianus）meaton D-galactose induced agingmicemodels and its potentialmechanism.Methods:A ll 72 KM m icewere randomized into blank controlgroup,agingmodelgroup,positive control(Vit E)group,low,moderate and high doses groups of giantsalamandermeat,12m ice each group.Exceptblank control group,micemodelswere prepared by peritoneal injection of D-galactoseaqueoussolution in the concentrationsof125mg/(kg·d);blank controlgroup were givenwater for injections in the same volume for seven consecutiveweeks;them ice in low,moderate and high doses groups of giantsalamandermeatategiantsalamandermeat respectively and freely in the concentrationsof16，32 and 48mg/(g·d),positive controlgroup received intragastric administration of VitE aqueous solution in the concentrationsof100mg/(kg· d),and blank controlgroupwater for injections in the same volume foreightconsecutiveweeks.The influence ofgiant salamandermeaton ethology and basic featuresof agingmicemodelswereobserved in eightweeks,theactivity of superoxide dismutase(SOD),the contents ofmalondialdehyde(MDA)and the activity of telomerase(TE)in the serum of them icewere detected.Results:Compared w ith blank control group,body weightof themice in the agingmodel group decreased notably,the activity of SOD and TE lowered,the contents of MDA increased(P＜0.01)；compared w ith themodelgroup,body weightof them ice in different doses groups of giant salamandermeat increased remarkably,the activity of SOD increased and the contentsofMDA decreased(P＜0.05)；the activity of TE in them ice of low andmoderate groups showed the tendency of rising,while the difference had no statisticalmeaning(P＞0.05)；the activity of TE in them ice of high doses group of giant salamandermeatand Vit E group rose obviously(P＜0.05).Conclusion:Giant salamandermeat show anti-aging effect on D-galactose induced aging mice models,itsmechanism m ightbe related to increasing the activity of SOD and TE in the serum of them ice and reducing the contentsofMDA.

agingmodel;m ice;giantsalamander;D-galactose;bodyweight;SOD;MDA;telomerase

R285.5

A

1004-6852(2015)07-0004-04

2014-09-02

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號200310441022）。

蔡佳佳（1992—），女，學(xué)生。研究方向：中西醫(yī)臨床與中醫(yī)復(fù)方現(xiàn)代化。

△通訊作者：徐凌川（1962—），男，教授。研究方向：中藥資源開發(fā)與質(zhì)量評價(jià)。