朱 艷 葛偉林

PTEN和FHIT在結(jié)直腸癌組織的表達(dá)和意義

朱 艷 葛偉林

目的 研究磷酸酯酶與張力蛋白同源物（PTEN）和脆性三聯(lián)組氨酸（FHIT）的表達(dá)與結(jié)直腸癌（CRC）臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。方法 102例CRC組織標(biāo)本，取53例癌旁組織正常結(jié)直腸黏膜做對照，采用免疫組織化學(xué)S-P法檢測PTEN和FHIT蛋白在CRC組織、正常組織中的表達(dá)情況，分析PTEN和FHIT的表達(dá)與CRC的相關(guān)性。結(jié)果 ①PTEN在CRC組織和正常組織中表達(dá)的陽性率分別為40.2%（41/102）和84.9%（45/53），兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；FHIT在CRC組織和正常組織中表達(dá)的陽性率分別為44.1%（45/102）和92.5%（49/53），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；②PTEN和FHIT的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小無顯著相關(guān)性（P＞0.05），與Dukes分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.01），PTEN的表達(dá)與腫瘤部位無關(guān)，F(xiàn)HIT的表達(dá)與腫瘤部位相關(guān)（P＜0.05）；③Spearman等級相關(guān)分析提示，PTEN和FHIT在CRC組織間的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.616，P＜0.01）。結(jié)論 PTEN和FHIT參與了CRC的發(fā)生發(fā)展過程，兩者聯(lián)合檢測對于評估CRC的生物學(xué)特性和判斷預(yù)后具有一定價值。

結(jié)直腸癌；磷酸酯酶與張力蛋白同源物；脆性三聯(lián)組氨酸

原癌基因的激活與抑癌基因的失活是腫瘤發(fā)生過程中重要的分子事件。磷酸酯酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）和脆性三聯(lián)組氨酸（fragile histidine triad，F(xiàn)HIT）都被認(rèn)為是重要的抑癌基因，其缺失和突變常導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[1-2]。

本研究通過免疫組織化學(xué)方法聯(lián)合檢測結(jié)直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）組織PTEN和FHIT蛋白的表達(dá)以及與CRC的臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，分析二者之間表達(dá)的相關(guān)性，以期為CRC的發(fā)生機制提供初步理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料 收集本院外科2007年2月—2013年行結(jié)直腸癌根治手術(shù)并具有完整臨床數(shù)據(jù)的病理標(biāo)本102例，并取53例距離腫瘤組織8cm以上的癌旁正常組織為對照，所有患者術(shù)前均未接受化療、靶向治療和放療。其中男63例，女39例；年齡34～77歲，平均年齡52.5歲。左半結(jié)腸癌22例，橫結(jié)腸癌9例，右半結(jié)腸癌20例，乙狀結(jié)腸癌17例，直腸癌34例。Dukes分期：A期17例，B期33例，C1期19例，C2期15例，D期18例；組織學(xué)分型：高分化15例，中分化24，低分化55例，未分化8例。對照標(biāo)本經(jīng)HE染色鏡下未見腫瘤細(xì)胞。

1.2 試劑和方法 一抗鼠抗人PTEN單克隆抗體和兔抗人FHIT單克隆抗體試劑盒均購自福州邁新公司。二抗及免疫組化試劑盒購自北京中杉生物科技公司。所有標(biāo)本均以10%福爾馬林固定，石蠟包埋，每例蠟塊以4μm厚度連續(xù)切片，用于免疫組化染色。應(yīng)用免疫組織化學(xué)鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）法，操作步驟按試劑盒提示進(jìn)行，切片經(jīng)處理后進(jìn)行HE染色和免疫組化染色。PTEN的工作濃度為1:200，F(xiàn)HIT的工作濃度為1:150。用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照，用已知的PTEN和FHIT陽性的胃癌切片作陽性對照。

1.3 結(jié)果判定 由兩名病理專家閱片，根據(jù)PTEN和FHIT在腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色染色判定為陽性。PTEN蛋白染色多位于細(xì)胞質(zhì)，癌巢中心染色較強，為棕黃色顆粒狀。FHIT蛋白染色多位于細(xì)胞質(zhì)，部分表達(dá)于細(xì)胞膜，為黃色或棕黃色顆粒狀。每張切片隨機選取10個高倍鏡視野（×400），根據(jù)陽性細(xì)胞百分率及顯色深淺進(jìn)行分類判斷。其中染色強度0：無染色；1：淡黃色；2：棕黃色；3：棕褐色。后按陽性細(xì)胞所占百分比記分：＜5%為0分，5%~ 25%為1分，25%~50%為2分，50%~75%為3分，＞75%為4分；根據(jù)兩項積分之和為每張切片組織染色結(jié)果，＞3分記為陽性，≤3分記為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，PTEN和FHIT表達(dá)相關(guān)性采用spearman相關(guān)分析方法，取P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTEN蛋白在CRC組織和正常組織表達(dá) 102例CRC中PTEN蛋白呈陽性表達(dá)41例，表達(dá)率40.2%；53例正常組織中PTEN蛋白陽性表達(dá)45例，表達(dá)率84.9%。PTEN在正常組織中表達(dá)高于CRC組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1

2.2 FHIT蛋白在CRC組織和正常組織表達(dá) 102例CRC中FHIT蛋白45例呈陽性表達(dá)，表達(dá)率44.1%；53例正常組織中陽性表達(dá)49例，表達(dá)率92.5%。FHIT在正常組織中表達(dá)高于CRC組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 PTEN和FHIT蛋白在CRC和正常黏膜表達(dá)（例）

2.3 PTEN和FHIT蛋白表達(dá)與CRC的臨床病理參數(shù)的關(guān)系 PTEN與FHIT的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小無顯著相關(guān)性（P＞0.05），而Dukes分期較晚、分化程度低和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，兩者表達(dá)呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)腸癌患者FHIT的表達(dá)高于直腸癌患者而PTEN表達(dá)與癌灶部位無關(guān)。見表2。

表2 PTEN和FHIT蛋白表達(dá)與CRC的臨床病理參數(shù)（例）

2.4 PTEN和FHIT相關(guān)性 在102例結(jié)直腸癌組織中，PTEN和FHIT表達(dá)均為陽性38例，均為陰性54例；PTEN表達(dá)陽性而FHIT表達(dá)陰性3例；PTEN表達(dá)陰性而FHIT表達(dá)陽性7例；采用spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示，PTEN與FHIT蛋白在結(jié)直腸癌組織表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.616，P＜0.01）。見表3。

表3 PTEN和FHIT的相關(guān)性（例）

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生是一個多因素、多階段、多步驟綜合作用的結(jié)果，其發(fā)生發(fā)展的分子機制仍未闡明。目前認(rèn)為，PTEN和FHIT蛋白的表達(dá)異常與CRC的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，但PTEN和FHIT與CRC的關(guān)系存在爭議。

PTEN基因由Li等在1997年首次發(fā)現(xiàn)，它定位于10q23.3，全長200kb，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為515kb mRNA，其蛋白產(chǎn)物含有一酪蛋白磷酸酶的功能區(qū)和約175個氨基酸左右的與骨架蛋白tenasin、auxilin同源的區(qū)域，是迄今發(fā)現(xiàn)第一個具有雙重磷酸酶活性的抑癌基因[1]。它可能通過阻斷酪氨酸蛋白激酶來抑制腫瘤細(xì)胞生長，抑制細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，并調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。PTEN由于基因突變、缺失、甲基化等過程使mRNA和蛋白表達(dá)降低，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。PTEN在人類消化道腫瘤、腎癌、乳腺癌中均存在表達(dá)缺失，被認(rèn)為與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，其低表達(dá)則預(yù)示患者預(yù)后不良[3-5]。Sawai等[6]通過比較PTEN在伴有和不伴有肝轉(zhuǎn)移的CRC組織表達(dá)，發(fā)現(xiàn)前者75.4%呈弱表達(dá)，在肝轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)缺失，后者62.9%呈強陽性表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)PTEN陽性表達(dá)患者的5年生存率顯著高于陰性表達(dá)患者。本研究證實，PTEN在CRC中出現(xiàn)特異性表達(dá)缺失，這與大多數(shù)研究結(jié)果相符。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在Dukes分期C-D期、結(jié)腸癌細(xì)胞低分化和未分化以及伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，PTEN的表達(dá)均較病理分期早、細(xì)胞分化好、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者低，提示該基因的缺失在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移方面有著重要作用。

FHIT基因是一種抑癌基因，定位于3p14.2區(qū)域，由10個外顯子組成，編碼的FHIT蛋白由147個氨基酸殘基組成，分子量為16 800，表達(dá)于人體多種器官如心、肝、腎以及消化道組織中[2]。FHIT的失活已有研究表明，F(xiàn)HIT表達(dá)的缺失見于胃癌、食管癌、卵巢癌、膀胱癌和肝癌等組織中，并與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。Nan等[7]通過免疫組化和TUNEL法檢測了47例原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中FHIT和PCNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)所有正常肝臟組織中均高表達(dá)FHIT，而59.6%肝癌組織中表達(dá)缺失，且FHIT的表達(dá)與病理分期和有無轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示FHIT在肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。但也有研究通過FHITmRNA的定量分析后發(fā)現(xiàn)，在86%的CRC和60%的腺瘤組織中都檢測到高水平表達(dá)，與免疫組化結(jié)果相吻合；且FHIT蛋白在Dukes’C/D期和N1/N2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC組織中亦呈高表達(dá)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HIT蛋白在正常組織表達(dá)高于CRC組織，推測FHIT蛋白可能是結(jié)直腸組織正常生長的必要因素之一；通過分析發(fā)現(xiàn)FHIT蛋白表達(dá)與CRC病理分期和組織分化程度關(guān)系密切，且在結(jié)腸癌和直腸癌中的表達(dá)存在差異，提示FHIT在結(jié)腸癌和直腸癌發(fā)生發(fā)展中可能存在不同的作用機制，有待進(jìn)一步研究。有學(xué)者[9]通過組織微陣列（TMA）和TUNEL方法對CRC中FHIT、Bax、Bcl-2和Survivin基因進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)FHIT基因突變導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)，同時伴有抗凋亡基因Bcl-2和Survivin表達(dá)的上調(diào)和凋亡基因Bax的下調(diào)。提示FHIT的突變可能通過以上途徑促進(jìn)正常結(jié)直腸黏膜向癌組織的轉(zhuǎn)變。

Zheng等[10]通過含有正常胃黏膜、腺瘤、胃癌組織的組織微陣列檢測了PTEN和FHIT的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PTEN和FHIT雙陽性患者預(yù)后相對較好，而且在胃癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，并提示PTEN和FHIT的下調(diào)可能打破了細(xì)胞凋亡和增殖平衡，而促進(jìn)癌變的發(fā)生。已有文獻(xiàn)對PTEN和FHIT蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性研究較少。本研究顯示，結(jié)直腸癌組織中PTEN和FHIT蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，兩個基因常存在同時失活現(xiàn)象，具體協(xié)同機制有待于今后進(jìn)一步研究。

本研究通過免疫組化方法聯(lián)合檢測PTEN和FHIT在結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織中表達(dá)的差異，初步證實PTEN和FHIT參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程。因此，聯(lián)合檢測結(jié)直腸癌組織中PTEN和FHIT蛋白的表達(dá)可為結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力提供參考價值，并對判斷結(jié)直腸癌患者的預(yù)后具有重要意義。

［1］Li J，Yen C，Liaw D，et al.PTEN，a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain，breast，andprostate cancer［J］.Science，1997，275（5308）：1943-1947.

［2］Croce CM，Sozzi G，Huebner K.Role of FHIT in human cancer［J］.JClin Oncol，1999，17（5）：1618-1624.

［3］Zou TT，Lei J，Shi YQ，et al.FHIT gene alterations in esophageal cancer and ulcerative colitis（UC）［J］.Oncogene，1997，15（1）：101-105.

［4］ Campiglio M，Pekarsky Y，Menard S，et al.FHIT loss of function in human primary breast cancer correlates with advanced stage of the disease［J］.Cancer Res，1999，59（16）：3866-3869.

［5］袁禧先，張丹，王鳳榮，等.基質(zhì)金屬蛋白酶-9與抑癌基因PTEN在大腸腺瘤、大腸癌組織中的表達(dá)及意義［J］.世界華人消化雜志，2008，16（10）：1132-1136.

［6］Sawai H，Yasuda A，Ochi N，et al.Loss of PTEN expression is associated with colorectal cancer liver metastasis and poor patient survival［J］.BMCGastroenterol，2008，8：56-62.

［7］Nan KJ，Ruan ZP，Jing Z，etal.Expression of fragile histi dine triad in primary hepatocellular carcinoma and its relation with cell proliferation and apoptosis［J］.World JGastroenterol，2005，11（2）：228-231.

［8］Wierzbicki PM，Adrych K，Kartanowicz D，et al.Fragile histidine triad（FHIT）gene is overexpressed in colorectal cancer［J］.JPhysiol Pharmacol，2009，60（Suppl 4）：63-70.

［9］Cao J，Li W，Xie J，et al.Down-regulation of FHIT inhibits apoptosis of colorectal cancer:mechanism and clinical implication［J］.Surg Oncol，2006，15（4）：223-233.

［10］Zheng H，Takahashi H，Murai Y，et al.Low expression of FHIT and PTEN correlates with malignancy of gastric carcinomas：tissue-array findings［J］.Appl Immunohistochem MolMorphol，2007，15（4）：432-440.

（收稿：2014-09-21 修回：2014-11-07）

Expressions of PTEN and FHIT in Colorectal Carcinoma and Their Clinical Pathological Significance

ZHU Yan,GE Weilin. Department of Surgery,Xiangshan County Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xiangshan (315711),China

Objective To investigate the expression of phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten（PTEN）and fragile histidine triad（FHIT）in colorectal cancer（CRC）and their relationship to clinical pathology of colorectal cancer.M ethods One hundred and 2 CRC specimens were collected and 53 specimens of adjacent normal mucosa tissues served as control.PTEN and FHIT expressions in CRC specimens and controls were detected by S-P method and their relationship with CRC was evaluated.Results The positive rate ofPTEN in CRC specimens and controls were 40.2%（41/102）and 84.9%（45/53）,and the expressions of FHIT were 44.1%（45/102）and 92.5%（49/53）,respectively,both with a significant difference（all P<0.01）.Both of PTEN and FHIT were related to Dukes stages and tumor pTNM classification（P<0.01）,but not related to gender,age,and size of the tumor（P>0.05）;PTEN was not related to the location of the tumor but FHIT was（P<0.05）.Spearman rank correlation analysis showed that PTEN was correlated with FHIT in CRC tissues（r=0.616,P<0.01）.Conclusion PTEN and FHIT were involved in the development and progress of CRC.To evaluate the expression of both proteins may be valuable for the study of biological features and prognosis of CRC.

colorectal carcinoma;phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten（PTEN）;fragile histidine triad（FHIT）

浙江省象山縣中醫(yī)院外科（象山 315711）

朱艷，Tel：18268892660；E-mial：zhuyanxs@sina.com