冉貴萍，黃 海，楊國珍＊，郭 鵬，袁 勇

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，貴州貴陽550004；2.上海奉賢區(qū)奉城醫(yī)院，上海201411）

肝細(xì)胞癌患者血漿循環(huán)DNA的定量分析及臨床意義

冉貴萍1，2，黃 海1，楊國珍1＊，郭 鵬2，袁 勇2

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，貴州貴陽550004；2.上海奉賢區(qū)奉城醫(yī)院，上海201411）

目的 定量檢測肝細(xì)胞癌（HCC）患者血漿循環(huán)DNA（cf－DNA）含量，探討其在原發(fā)性肝癌早期診斷及病情監(jiān)測中的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 收集40例肝細(xì)胞癌、30例代償期肝硬化、20例活動(dòng)性肝炎和25例正常健康對照血漿，提取血漿循環(huán)DNA，采用real－time實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測β－actin基因的表達(dá)，確定血漿循環(huán)DNA的水平。結(jié)果 HCC組、肝硬化組、肝炎組和健康對照組中位血漿循環(huán)DNA濃度分別為17.090ng／ml、8.182ng／ml、7.447 ng／ml和9.014ng／ml，HCC組和健康對照組循環(huán)DNA水平比較有顯著性差異（P＜0.05）；肝硬化組、肝炎組和健康對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），ROC曲線分析表明血漿循環(huán)DNA水平能夠區(qū)分肝癌和健康人（AUC＝0.8450），以循環(huán)DNA水平11.92ng／ml作為診斷HCC的臨界值，其診斷的特異度是84.0%，敏感度是72.5%。血漿cf－DNA濃度與AFP聯(lián)合檢測可以將HCC診斷率提高至77.5%。結(jié)論 real time PCR技術(shù)可精確定量血漿循環(huán)DNA濃度，檢測血漿中循環(huán)DNA含量可作為診斷和監(jiān)測原發(fā)性肝癌指標(biāo)的有效補(bǔ)充。

肝細(xì)胞癌；循環(huán)DNA；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0918）

早期診斷是原發(fā)性肝癌獲得早期治療的前提，肝癌有強(qiáng)大的代償能力，早期常無癥狀，這給肝癌的早期診斷帶來一定的困難，因此，尋找外周血腫瘤標(biāo)記是臨床上亟需解決的一個(gè)難題。另外，對肝癌術(shù)后患者復(fù)發(fā)進(jìn)行有效監(jiān)測也是控制肝癌，提高生存率的關(guān)鍵［1－3］。循環(huán)無細(xì)胞DNA（circulating cellfree DNA，cf－DNA）是存在于血清和血漿中的游離DNA，近年研究表明［4－7］，腫瘤在生長過程中持續(xù)釋放腫瘤細(xì)胞DNA進(jìn)入外周血液，因此，檢測血清或血漿的循環(huán)DNA含量的變化，可反映腫瘤的存在和嚴(yán)重程度，同時(shí)循環(huán)DNA檢測具有微創(chuàng)性，標(biāo)本獲取方便，價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，因此腫瘤循環(huán)DNA的研究可為腫瘤標(biāo)志物開辟一片廣闊前景。本研究旨在通過對健康人群、肝炎、肝硬化及HCC病人血漿中循環(huán)DNA濃度的測定，探討血漿中循環(huán)DNA的檢測在原發(fā)性肝癌早期診斷中的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 40例肝細(xì)胞癌（HCC）均為住院病例，其中男性29例，女性11例，年齡38－65歲，中位年齡58歲。全部病例均經(jīng)病理組織學(xué)診斷為原發(fā)性肝癌，其中AFP≥400μg／L的22例。30例肝硬化患者組，其中男性18例，女性12例，年齡36－79歲，中位年齡65歲。20例肝炎患者組，其中男性12例，女性8例，年齡35－75歲，中位年齡62歲。25例健康對照血漿來自健康體檢者，男性15例，女性10例，年齡35－72歲，中位年齡60歲。四組資料在年齡及性別上比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 標(biāo)本采集 所有HCC病例均于入院后次日留取靜脈血標(biāo)本，全部標(biāo)本經(jīng)低溫離心機(jī)4℃3 000 rpm離心15min后分離血漿，以每管800μl分裝置－20℃保存?zhèn)溆谩Ｏ嗤椒ú杉４?0例肝臟良性疾病、25例健康體檢者血漿。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血漿DNA的抽提和純化 血漿DNA的抽提采用血液DNA快速提取試劑盒（深圳亞能公司），對其中的操作步驟適當(dāng)改良（按比例擴(kuò)大每次處理的血漿量，DNA得率和純度無影響），每300μl血漿獲得80μl的DNA，所有保存血漿標(biāo)本均采用同一批號的試劑盒抽提DNA以減少批間誤差并統(tǒng)一集中檢測。

1.3.2 血漿DNA定量 采用ABI7500進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。β肌動(dòng)蛋白（β－actin）擴(kuò)增引物序列為：正向引物5’－AAGGTGACAGCAGTCGGTTGGA－3’，反向引物5’－GAGAAGTGGGGTTTTAGGA－3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為156bp。正常人白細(xì)胞基因組DNA用NanoDrop ND－1000定量，再用easy solution溶液（Takara）梯度稀釋（250、50、10、2）ng／ml后作為標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，對待測樣品進(jìn)行定量。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為20μl，包括7.2μl蒸餾水，10μl SYBR GreenⅠ，0.4μl的上游引物和0.4μl的下游引物，2μl模板。反應(yīng)條件為：95℃1m，1個(gè)循環(huán)，95℃10s，60℃30s，35個(gè)循環(huán)，95℃1s，65℃持續(xù)收集。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部資料用SPSS 17.0軟件分析，采用非參數(shù)檢驗(yàn)比較不同組間血漿DNA水平的差異，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平為P＜0.05，ROC曲線評估采用GraphPad Prism（V5.0，GraphPad Software）進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組病例的血漿循環(huán)DNA的濃度與健康對照組循環(huán)DNA濃度的比較 原發(fā)性肝癌組血漿循環(huán)DNA水平中位值為17.090ng／ml（7.870－48.010 ng／ml），明顯高于健康對照組9.014ng／ml（2.664－25.820ng／ml）（P＜0.05）；肝硬化組血漿循環(huán)DNA水平中位值為8.182ng／ml（2.464－40.360 ng／ml），和健康對照組的血漿循環(huán)DNA濃度比較無明顯差異（P＞0.05）；肝炎組血漿循環(huán)DNA平均濃度為7.447ng／ml（3.086－38.710ng／ml），和健康對照組的血漿循環(huán)DNA濃度比較無明顯差異（P＞0.05）。（見表1）

表1 HCC組、肝硬化組、肝炎組和健康對照組血漿DNA含量比較

2.2 ROC曲線分析用于評價(jià)血漿循環(huán)DNA濃度的檢測對于診斷肝癌的價(jià)值 如圖1所示，肝癌組與健康對照組的血漿循環(huán)DNA濃度進(jìn)行比較，AUC值（0.8450）大于0.5，統(tǒng)計(jì)學(xué)表明血漿循環(huán)DNA水平可作為輔助診斷肝癌的指標(biāo)（P＜0.05），以血漿循環(huán)DNA濃度11.92ng／ml作為診斷HCC的臨界值，其診斷特異度為84.0%，敏感度達(dá)72.5%。而肝硬化組與健康對照組比較的AUC值為0.6212，略高于0.5，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較表明不足以將兩者區(qū)分開（P＝0.1920），肝炎組與健康對照組比較的AUC值為0.6667，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較表明不足以將兩者區(qū)分開（P＝0.0833）。

2.3 聯(lián)合血漿循環(huán)DNA的檢測和AFP的檢測兩項(xiàng)指標(biāo)對肝癌早期診斷的意義 2001年9月全國肝癌學(xué)術(shù)會(huì)議確定將AFP≥400μg／L作為HCC臨床診斷的陽性閾值［8］。在本研究中，HCC組中有22例AFP≥400μg／L，單獨(dú)用AFP指標(biāo)對HCC的診斷率為55%，在18例AFP＜400μg／L的患者中，有9例患者血漿循環(huán)DNA濃度增高超過臨界值，因此，聯(lián)合兩項(xiàng)指標(biāo)可將肝癌的診斷率提高至77.5%（31／40）。

圖1 ROC曲線分析

3 討論

循環(huán)DNA是存在于血清和血漿中的游離DNA，近年來日益增多的研究表明，腫瘤在生長過程中能持續(xù)釋放腫瘤細(xì)胞DNA進(jìn)入外周血液，循環(huán)DNA能維持和表達(dá)腫瘤細(xì)胞來源的分子遺傳特性，因此通過檢測血漿循環(huán)DNA的總量可以反映腫瘤的存在和嚴(yán)重程度。2006年，逄錦忠［9］等報(bào)道，HCC患者血漿循環(huán)DNA與腫瘤組織微衛(wèi)星變異有較高的一致性變化，血漿循環(huán)DNA可以用來反映腫瘤組織的微衛(wèi)星變異。2008年，Catherine［10］等報(bào)道，血漿中結(jié)腸癌特異性甲基化DNA可用于結(jié)腸癌的篩查。2009年，Eric［11］等通過熔解曲線分析技術(shù)對外周血甲基化DNA進(jìn)行定量，用以診斷腫瘤。2012年，蔣葉［12］等人動(dòng)態(tài)監(jiān)測急性髓系白血病（AML）患者血漿循環(huán)DNA的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AML患者組血漿DNA含量顯著高于對照組，血漿DNA定量檢測對AML的化療療效判斷和復(fù)發(fā)監(jiān)測具有重要意義。因此，外周血循環(huán)DNA定量可能成為一種新的腫瘤診斷及預(yù)后判斷的標(biāo)志物。本研究主要通過檢測肝癌患者外周血循環(huán)DNA的含量變化，探討外周血循環(huán)DNA水平作為肝癌早期診斷指標(biāo)的可行性，實(shí)驗(yàn)中通過定量檢測健康人、慢性活動(dòng)性肝炎、肝硬化及肝癌患者血漿循環(huán)DNA濃度，結(jié)果顯示肝炎組、肝硬化組血漿循環(huán)DNA濃度與健康組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而肝癌組DNA含量較健康組高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。ROC曲線分析表明，血漿循環(huán)DNA定量對肝癌具有較高診斷價(jià)值（AUC＝0.8450），當(dāng)最佳臨界值（CUTOFF值）為11.92ng／ml時(shí)，敏感性為72.5%，特異性為84.0%，因此，外周血循環(huán)DNA水平對肝癌的診斷有一定價(jià)值。

目前臨床上原發(fā)性肝癌常用的輔助診斷和監(jiān)測的血清學(xué)指標(biāo)是AFP，然而AFP的靈敏度有限，AFP診斷原發(fā)性肝癌的陽性率為55%－65%［13，14］。本組實(shí)驗(yàn)在AFP陽性（≥400μg／L）檢測的22例患者中，20例患者血漿循環(huán)DNA濃度大于CUTOFF值11.92μg／L，在AFP陰性（＜400μg／L）檢測的18例患者中有9例患者血漿循環(huán)DNA濃度大于CUTOFF值，可以看出血漿循環(huán)DNA濃度檢測比傳統(tǒng)的血清蛋白腫瘤標(biāo)志物的檢測更靈敏，更有利于腫瘤的早期診斷。另外，在有些病例中，循環(huán)核酸的水平隨著成功的抗癌治療而下降，這提示循環(huán)中游離DNA可以被用來監(jiān)測疾病的進(jìn)展。由于所獲得病例數(shù)有限，對肝癌患者進(jìn)行血漿循環(huán)DNA定量檢測可能用于抗癌療效監(jiān)測還有待進(jìn)一步研究。

以循環(huán)DNA為基礎(chǔ)的核酸分析，具有取材容易、微創(chuàng)傷性等特點(diǎn)，并適合動(dòng)態(tài)檢測，避免了采集癌組織作為標(biāo)本來源的困難，因此，在腫瘤篩查方面極具前景，但由于血漿循環(huán)DNA并不具有HCC的特性，因此聯(lián)合檢測血漿循環(huán)DNA含量和血漿循環(huán)DNA中HCC特異性基因改變?nèi)缂谆?、SNP等可能是將來這一領(lǐng)域的主要研究方向，有望為肝癌的早期診斷、預(yù)后監(jiān)測提供更加敏感、特異的指標(biāo)。

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Quantitative analysis of circulating DNA level in plasma from patients with hepatocellular carcinoma and its clinical signif－icance

RAN Gui－ping1，2，HUANG Hai1，YANG Guo－zhen1，et al.（1.Guiyang Medical College，Guiyang550004，China；2.Shanghai Fengcheng Hospital，Shanghai 201411，China）

Objective To quantify the circulating DNA level in plasma from patients with hepatocellular carcinoma（HCC），and to explore its significance for early diagnosis in HCC patients.Methods Blood samples were collected from 40HCC patients，30patients with liver cirrhosis，20patients with chronic active hepatitis and 25healthy controls.Circulating DNA in plasma was extracted and quantified by detecting theβ－actin gene through real－time quantitative PCR method.Results The median values of plasma circulating DNA concentration among the HCC group，cirrhosis group，hepatitis group and healthy control group were 17.090ng／ml，8.182ng／ml，7.447ng／ml and 9.014ng／ml respectively.There is significant difference between the HCC group and healthy control（P＜0.05）and no significant difference between the cirrhosis group and healthy control（P＞0.05），no significant difference between the hepatitis group and healthy control（P＞0.05）.Receiver operating characteristic（ROC）analysis demonstrated that the circulating DNA level could be used to distinguish HCC from healthy control（AUC＝0.8450）with sensitivity of 72.5%and specificity of 84.0%at the cut－off value of 11.92ng／ml.The combined analysis of using both plasma circulating DNA level and AFP revealed an elevated detection rate of 77.5%.Conclusion The detection of plasma circulating DNA level can be an effective supplement index for the diagnosis of HCC.

Hepatocellular carcinoma；Circulating DNA；real－time PCR

R735.7

A

冉貴萍，女，42歲，碩士，副主任技師，研究方向：腫瘤分子診斷。

2014－10－15）

1007－4287（2015）06－0918－04

國家級教學(xué)團(tuán)隊(duì)（教高函［2009］18號）

＊通訊作者