鄧曉晶，鄧 敏，宋育林，王啟之

miRNA-34a對人胃癌SGC-7901細胞增殖、凋亡的影響

鄧曉晶1，2，鄧 敏2，宋育林1，王啟之2

目的研究microRNA-34a（mir-34a）在人胃癌細胞中的表達水平及對胃癌SGC-7901細胞增殖、凋亡的影響。方法通過實時定量PCR（RT-PCR）檢測人正常胃黏膜上皮細胞GES及人胃癌細胞株AGS、SGC-7901、MKN-45、BGC-823中mir-34a的表達水平。體外將表達人mir-34a（has-mir-34a）慢病毒感染人胃癌SGC-7901細胞。熒光顯微鏡觀察評估細胞感染情況，MTT實驗、流式細胞術檢測感染后胃癌SGC-7901細胞的增殖、細胞周期及凋亡情況。結果胃癌細胞AGS、SGC-7901、MKN-45、BGC-823中mir-34a的表達水平較正常胃黏膜上皮細胞GES明顯降低，其中以胃癌SGC-7901細胞降低最為明顯（P＜0.01）。與陰性對照組相比，mir-34a感染組SGC-7901細胞增殖明顯減慢（P＜0.01），G1／G0期細胞比例顯著增加（P＜0.05），細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）。結論mir-34a在多種人胃癌細胞，尤其是SGC-7901細胞中呈低表達。mir-34a可以抑制胃癌SGC7901細胞的增殖，誘導細胞周期停滯及細胞凋亡。

胃癌；SGC-7901細胞；微小RNA；microRNA-34a；增殖；凋亡

胃癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在世界范圍內，胃癌位居癌癥發(fā)病率第4位，死亡率第2位［1］。胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個復雜過程，涉及到多種致癌的信號傳導通路，其中表觀遺傳學變化的作用越來越受到重視［2］。微小RNA（microRNA，miRNA）作為一類高度保守的、非編碼、小分子調節(jié)RNA參與癌癥發(fā)生、發(fā)展的表觀遺傳調控機制已備受矚目［3］。研究［4］顯示，miRNA的表達水平失調出現(xiàn)在眾多惡性腫瘤中，而人類一半以上的miRNA基因位于染色體上腫瘤相關性基因位點，這提示miRNA具有癌基因或抑癌基因的功能。miRNA-34家族（mir-34s）受著名的“基因守護者”p53直接調控［5］，其腫瘤抑制功能在多種惡性腫瘤中（結直腸癌、肺癌、惡性膠質瘤、胰腺癌等）均被證實［6－7］。該研究通過檢測多種人胃癌細胞株中mir-34a的表達水平，最終選定胃癌SGC-7901細胞為研究對象，通過穩(wěn)定轉染外源性has-mir-34a進一步研究其對細胞增殖、周期及凋亡的影響，旨在為miRNA作為胃癌分子靶向治療的可能性提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑人正常胃黏膜上皮細胞株GES、人胃癌細胞株AGS、SGC-7901、MKN-45、BGC-823由上海細胞生物研究所提供；胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；總RNA提取試劑盒TRIzol購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒M-MLV購自美國Promega公司；SYBR premix ex taq試劑盒購自美國Axygen公司；目的基因及內參基因上下游引物購自廣州銳博生物公司；has-mir-34a、陰性對照慢病毒表達載體及質粒由上海吉凱基因公司合成；噻唑藍（MTT）試劑盒購自北京鼎國生物技術有限責任公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）購自美國Sigma公司；RNase A購自加拿大Fermentas公司；細胞凋亡試劑盒購自美國eBioscience公司。

1.2 細胞培養(yǎng)復蘇GES、AGS、SGC-7901、MKN-45、BGC-823細胞，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 d換液，將生長90%匯合的細胞進行傳代。

1.3 實時定量PCR（RT-PCR）檢測各細胞株mir-34a的表達水平收集生長狀態(tài)良好的細胞，加入1 ml TRIzol試劑、200μl氯仿，離心后取上層液體，加入等體積預冷的異丙醇，離心后棄上清液，以75%乙醇溶液洗滌沉淀，待RNA沉淀基本透明時，加入RNase-free水至充分溶解，Nanodrop 2000分光光度計分析測定抽提總RNA的質量及濃度，應用MMLV試劑盒逆轉錄合成cDNA。在包含上下游引物、cDNA、2×SYBR premix ex taq等的反應體系中，以U6作為內參，進行RT-PCR擴增。試驗獨立重復3次，每次設3個復孔。目的基因表達豐度以2－ΔΔCt方法進行相對定量，取復孔平均值進行后續(xù)統(tǒng)計學分析。

1.4 has-mir-34a慢病毒表達載體的合成及感染has-mir-34a慢病毒顆粒及陰性對照病毒顆粒由上海吉凱基因公司合成提供。has-mir-34a序列為5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’，陰性對照序列為：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTCTC-3’。收集處于對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，病毒感染前1 d將細胞分入6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，按實驗設計分組，感染當天于各組分別加入包裝完備的慢病毒顆粒進行感染實驗。感染3 d后應用熒光顯微鏡觀察各組綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達情況。本實驗分為3組：空白組，即未感染任何病毒組；陰性對照組（NC組），即感染陰性對照病毒組；mir-34a組，即感染has-mir-34a病毒組。

1.5 MTT法檢測細胞增殖于慢病毒感染第4天進行。將待測各實驗組SGC-7901細胞胰酶消化并計數(shù)，以3 000個細胞／孔接種于96孔板中，每組設5個復孔。顯微鏡觀察并調整細胞密度后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)5 d。每天于培養(yǎng)終止前4 h加入20μl濃度為0.01 mol／L的MTT于孔中，4 h后完全吸去培養(yǎng)液，加150μl二甲基亞砜（DMSO）溶解甲瓚顆粒，振蕩器振蕩5～10 min，用酶標儀在490 nm波長處測定其吸光度（optical delnsity，OD）值，即OD490。計算各組細胞每天相對于第1天的增殖倍數(shù)（OD490／fold），并以時間為橫坐標，OD490／fold為縱坐標繪制細胞增殖曲線圖。

1.6 流式細胞術檢測細胞周期于慢病毒感染第6天進行。待各實驗組SGC-7901細胞于60 mm培養(yǎng)皿中生長至覆蓋率80%左右時，評估細胞生長未進入平臺期。予以洗滌、消化后收集細胞于5 m l離心管中，每組設3個復孔。4℃預冷的PBS緩沖液洗滌細胞沉淀1次，70%酒精固定細胞至少1 h，PBS再次洗滌細胞沉淀一次。加入細胞染色液PI，充分重懸后上流式細胞儀檢測各組SGC-7901細胞周期。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡于慢病毒感染第6天進行。收集各實驗組SGC-7901細胞，胰酶消化后，收集細胞于5 m l離心管中，每組設3個復孔。離心后棄上清液，細胞沉淀以PBS洗滌1次，離心后重懸。取細胞懸液加入Annexin V-APC染色，于室溫下充分避光10～15 min。上流式細胞儀檢測各組SGC-7901細胞凋亡。

1.8 統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本間t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 mir-34a在各細胞株中的表達情況RT-PCR結果顯示，mir-34a在人胃癌細胞株AGS、SGC-7901、MKN-45和BGC-823中的相對表達量均分別明顯低于其在正常人胃黏膜上皮細胞GES的相對表達量，差異均有統(tǒng)計學意義（t＝17.522、22.879、13.836、14.393，P＜0.05），其中以胃癌細胞SGC-7901的mir-34a相對表達量降低最為明顯（P＜0.01）。見圖1。

2.2 慢病毒感染效率評估慢病毒感染SGC-7901細胞3d后，熒光顯微鏡觀察GFP表達率已達80%以上，見圖2。待細胞長滿培養(yǎng)板收集細胞進行后續(xù)實驗。

2.3 mir-34a對SGC-7901細胞增殖的影響通過MTT法連續(xù)5 d檢測各組細胞的增殖活性，繪制增殖曲線。與NC組相比，mir-34a組SGC-7901細胞增殖活性明顯降低，從檢測第3天起至第5天差異有統(tǒng)計學意義（t＝4.567，P＜0.01；t＝7.265，P＜0.01；t＝4.500，P＜0.01）。見圖3。

2.4 mir-34a對SGC-7901細胞周期的影響通過流式細胞術檢測提示，與NC組相比，mir-34a組SGC-7901細胞的G1／G0期細胞比例明顯增高（t＝－4.804，P＜0.05），S期細胞比例明顯減低（t＝5.149，P＜0.05），但G2／M期變化不大，表明過表達mir-34a可以導致SGC-7901細胞生長停滯于G1／ G0期。見圖4。

2.5 mir-34a對SGC-7901細胞凋亡的影響通過Annexin V-APC單染法，流式細胞術檢測顯示，mir-34a組SGC-7901細胞凋亡率明顯高于NC組（t＝－13.226，P＜0.01），表明mir-34a能夠顯著誘導SGC-7901細胞凋亡。見圖5。

3 討論

mir-34a是mir-34s成員之一，其編碼基因位于1p36.22，該區(qū)域在多種惡性腫瘤中發(fā)生缺失［4］或在啟動子區(qū)存在高度的甲基化，導致mir-34a表達異常；同時通過熒光素酶報告分析提示mir-34a的編碼基因存在腫瘤抑制蛋白p53的結合位點，p53可以通過直接綁定這些結合位點誘導mir-34a表達［8］，這些均提示了mir-34a具有腫瘤抑制功能。Welch et al［9］在成神經瘤細胞中通過過表達mir-34a成功誘導了細胞凋亡。隨后的多項研究［5－6］顯示，mir-34a可以引起腫瘤細胞的功能抑制，包括增殖活性減弱、細胞周期停滯、細胞凋亡，同時mir-34a還可抑制EMT介導的細胞侵襲和轉移［10］，并對腫瘤干細胞有明顯的抑制作用［7］。

mir-34a的作用發(fā)揮存在著多樣性，并可能依賴于細胞背景，比如在H1299肺癌細胞中轉染了外源性mir-34a后引起了細胞凋亡，而同樣的方法作用于U-2OS骨肉瘤細胞后則僅僅引起了細胞的G1期停滯［11］。故為進一步明確mir-34a在胃癌細胞中的作用，本研究首先通過RT-PCR檢測了多種胃癌細胞株的mir-34a的表達，發(fā)現(xiàn)與正常胃黏膜上皮細胞相比，胃癌細胞中mir-34a的表達水平顯著降低。這一結果提示了mir-34a作為胃癌篩查指標的可能性。之后，在胃癌SGC-7901細胞中，通過穩(wěn)定轉染外源性mir-34a顯著抑制了胃癌細胞的增殖，誘導了細胞G1／G0期停滯及細胞凋亡。在胃癌細胞株中，mir-34a抑制增殖、誘導細胞周期停滯和細胞凋亡的作用機制，可能在于其對眾多相關靶基因的負性調控。mir-34a通過其5’端的特異性序列識別靶mRNA的3’UTR區(qū)，以完全或不完全互補的方式結合并降解mRNA或抑制其翻譯，在轉錄后水平沉默靶基因的表達。Ji et al［12］在p53突變型胃癌細胞Kato III中通過熒光素酶實驗證實了抗凋亡蛋白Bcl-2是mir-34a的直接作用靶基因，通過外源性恢復mir-34a的表達，使得Bcl-2在mRNA和蛋白水平均受到了明顯抑制，并最終導致細胞凋亡的增加。研究［13］證明了mir-34a在胃癌組織中呈低表達，并在胃癌AGS細胞中證實了mir-34a通過靶作用于血小板生長因子受體PDGFR和酪氨酸激酶受體MET而阻礙了PI3K／AKT通路的激活，從而抑制了胃癌細胞的侵襲和轉移。研究［14］顯示mir-34a在順鉑耐藥的胃癌細胞株中表達量明顯減低，過表達mir-34a可以提高胃癌細胞對順鉑的化療敏感性，而這一機制可能是通過mir-34a靶作用于生存素survivin而實現(xiàn)。但亦有報道［15］表明，高mir-34a表達出現(xiàn)在肝細胞癌中，并與癌癥的進展呈正相關性，這使得mir-34a腫瘤抑制者的角色受到質疑。本研究證實，mir-34a對胃癌SGC-7901細胞功能產生抑制作用，但確切機制尚不清楚，為此將進一步探討mir-34a對胃癌SGC-7901細胞功能抑制的機制。

由于在p53突變型惡性腫瘤細胞中mir-34a的匱乏，使得重新引入、恢復mir-34a的表達有可能成為一種新的腫瘤治療方法。目前，MIX34已作為首個治療性microRNA用于不能手術切除的原發(fā)性肝癌或轉移性肝癌治療研究的一期實驗（http：／／clinicaltrials.gov／ct2／show／NCT01829971）。本研究顯示了mir-34a對胃癌細胞的抑制作用，提示通過微小RNA在腫瘤中的表觀遺傳調控機制，建立起胃癌新型診治方法的可能性。而這一目標的實現(xiàn)，有賴于從體外研究發(fā)展至更多樣本量的活體內研究，以此為miRNA用于胃癌治療提供更為充分的依據。

［1］ Jemal A，Bray F，Center M M，et al.Global cancer statistics［J］. CA Cancer JClin，2011，61（2）：69－90.

［2］ Shi J，Qu Y P，Hou P.Pathogeneticmechanisms in gastric cancer［J］.World JGastroenterol，2014，20（38）：13804－19.

［3］ Taby R，Issa J P.Cancer epigenetics［J］.CA Cancer J Clin，2010，60（6）：376－92.

［4］ Calin G，Sevignani C，Dumitru C，et al.Human microRNAgenes are frequently located at fragile sitesand genomic regions involved in cancers［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（9）：2999－3004.

［5］ He L，He X，Lim LP，etal.AmicroRNA componentof the p53 tumour suppressor network［J］.Nature，2007，447（7148）：1130－4.

［6］ Chang T C，Wentzel E A，Kent O A，et al.Transactivation of miR－34a by p53 broadly influences gene expression and promotes apoptosis［J］.Mol Cell，2007，26（5）：745－52.

［7］ Nalls D，Tang SN，Rodova M，etal.Targeting epigenetic regulation ofmiR-34a for treatment of pancreatic cancer by inhibition of pancreatic cancer stem cells［J］.PLoS One，2011，6（8）：e24099.

［8］ Raver-Shapira N，Marciano E，Meiri E，etal.Transcriptional activation ofmiR-34a contributes to p53-mediated apoptosis［J］.Mol Cell，2007，26（5）：731－43.

［9］ Welch C，Chen Y，Stallings R L.MicroRNA-34a functions as a potential tumor suppressor by inducing apoptosis in neuroblastoma cells［J］.Oncogene，2007，26（34）：5017－22.

［10］Rokavec M，?ner M G，Li H，et al.IL-6R／STAT3／miR-34a feedback loop promotes EMT-mediated colorectal cancer invasion and metastasis［J］.JClin Invest，2014，124（4）：1853－67.

［11］Hermeking H.The miR-34 family in cancer and apoptosis［J］. Cell Death Differ，2010，17（2）：193－9.

［12］JiQ，Hao X，Meng Y，etal.Restoration of tumor suppressormiR-34 inhibits human p53-mutant gastric cancer tumorspheres［J］. BMCCancer，2008，8：266.

［13］Peng Y，Guo J J，Liu Y M，et al.MicroRNA-34A inhibits the growth，invasion andmetastasis of gastric cancer by targeting PDGFR and MET expression［J］.Biosci Rep，2014，34（3）：247－56.

［14］CaoW，Yang W，F(xiàn)an R，et al.miR-34a regulates cisplatin-induce gastric cancer cell death by modulating PI3K／AKT／survivin pathway［J］.Tumour Biol，2014，35（2）：1287－95.

［15］Pineau P，Volinia S，McJunkin K，etal.miR-221 overexpression contributes to liver tumorigenesis［J］.Proc Natl Acad Sci U SA，2010，107（1）：264－9.

Effects ofm iRNA-34a on the proliferation and apoptosis of gastric cancer SGC-7901 cells

Deng Xiaojing1，2，Deng Min2，Song Yulin1，et al
（1Dept of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Anhui Key Laboratory of Digestive Diseases，Hefei 230022；2Deptof Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233004）

Objective To investigate the expression level ofmicroRNA-34a（miRNA-34a，mir-34a）in human gastric cancer cell lines，and explore the role ofmir-34a on the proliferation and apoptosis of human gastric cancer cell line SGC-7901.MethodsThe expression levels ofmir-34a in human gastricmucosal epithelial cells GESand human gastric cancer cell lines AGS，SGC-7901，MKN-45，BGC-823 were detected by RT-PCR.Gastric cancer SGC-7901 cellswere infected with the lentiviral system expressingmir-34a in vitro.The infected cells statuswas evaluated by fluorescence microscope.The proliferation，cell cycle and apoptosis were measured by MTT and flow cytometry.ResultsCompared with GES，the expression level ofmir-34a decreased significantly in gastric cancer cell lines，especially in SGC-7901（P＜0.01）.The ratios of proliferation inhibition，cells arrested at G1／G0 phase and apoptosis were significantly increased in mir-34a lentiviral infected group compared with the negative control group（P＜0.05）.ConclusionMir-34a has lower expression level in some gastric cancer cell lines.Mir-34a can inhibit the proliferation，induce cell cycle arrest and cell apoptosis of gastric cancer cell line SGC7901.

gastric cancer；SGC-7901 cells；microRNA；microRNA-34a；proliferation；apoptosis

R 735.2

A

1000－1492（2015）08－1090－05

2015－04－08接收

安徽省優(yōu)秀青年人才基金重點項目（編號：2013SQRL053ZD）

1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化內科，安徽省消化系統(tǒng)疾病重點實驗室，合肥 230022

2蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院消化內科，蚌埠 233004

鄧曉晶，女，碩士研究生，主治醫(yī)師；

宋育林，男，副教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：ylsongcn＠163.com