何 旭，黃 成，孟曉明，劉新華，李 俊

以二氫吡唑為先導的新型化合物靶向hTERT抑制SMMC-7721的增殖

何 旭1，2，3，黃 成1，2，3，孟曉明1，2，3，劉新華1，李 俊1，2，3

目的觀察以二氫吡唑為先導的新型化合物對人肝癌細胞株SMMC-7721增殖抑制的影響。方法采用噻唑藍（MTT）比色法篩選對SMMC-7721細胞株增殖的抑制作用較強的小分子化合物，并用流式細胞周期實驗觀察化合物對細胞周期的影響，采用改良的端粒重復序列擴增程序（TRAP）實驗檢測端粒酶的活性，Western blot法檢測化合物對hTERT蛋白表達的影響。結果與香豆素類衍生物相對比，新型二氫吡唑類化合物顯示出較好的抑制腫瘤細胞增殖的作用；流式細胞周期檢測結果顯示該化合物通過S期阻滯影響細胞增殖；改良的TRAP實驗結果顯示該化合物對端粒酶的活性具有較明顯的抑制作用；Western blot法結果顯示該化合物可以顯著降低hTERT蛋白的表達。結論以二氫吡唑為先導的新型化合物具有抑制SMMC-7721細胞的增殖的作用和周期阻滯作用，初步發(fā)現(xiàn)這主要是通過靶向hTERT抑制端粒酶的活性實現(xiàn)的。

二氫吡唑；香豆素；人肝癌細胞株SMMC-7721；增殖抑制；hTERT

人端粒酶是由人端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）、人端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR）以及人端粒酶相關蛋白（human telomerase-associated protein1，hTP1）等部分組成。研究［1－2］顯示端粒酶與腫瘤細胞的永生性關系密切。而腫瘤細胞的永生性是導致腫瘤發(fā)生發(fā)展的關鍵因素。因此，近年來端粒酶已成為抗腫瘤藥物篩選的新靶點，但由于其結構的復雜性至今仍未找到一個既高活性又高選擇性的先導結構。端粒酶的3個亞單位中，hTR和hTP1在癌細胞中為高表達，在癌旁組織內也有表達；然而hTERT僅在癌細胞內高表達，在癌旁組織內表達極少，且其表達水平與端粒酶活性及腫瘤的惡性程度呈正相關性［3－4］。因此，設想以端粒酶結構明確部位hTERT為靶點將能取得更好的抑制腫瘤效果。據(jù)此，該課題設計合成了以二氫吡唑及新型香豆素類衍生物等一系列小分子化合物經(jīng)過篩選以尋找可以通過靶向hTERT抑制腫瘤細胞增殖的小分子化合物。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 細胞株 人肝癌細胞株SMMC-7721、人肝癌細胞株HepG2、人胃腺癌細胞株（human gastric cancer cell line-7901，SGC-7901）以及人乳腺癌細胞株（michigan cancer foundation-7，MCF-7）均購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 試劑 胎牛血清（杭州四季青公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；胰酶細胞消化液（上海碧云天生物技術有限公司）；hTERT兔抗人單克隆抗體（英國Abcam公司）；小鼠抗β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；蛋白上樣緩沖液、蛋白Marker、ECL Western blot Detection化學發(fā)光試劑盒（美國Thermo公司）；端粒酶活性檢測試劑盒（美國Millipore公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、流式細胞周期試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；5-氟尿嘧啶注射液（5-fluorouracil，5-Fu）（天津金耀氨基酸有限公司）；溴化乙錠、3′-疊氮-3′-脫氧胸苷（3′-azido-3′-deoxythymidine，AZT）、噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司）。

1.1.3 實驗器材 Muliskan MK3型酶標儀（上海雷勃分析儀器公司）；SW-CJ-IF型醫(yī)用超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；2306-Z型細胞培養(yǎng)箱（美國Shellab公司）；5415R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Powker Pac Basic電泳儀、半干轉儀（美國Bio-rad公司）；EPICSXL-MCL型流式細胞儀（美國COULTER公司）；WD-9405B型水平搖床（北京沃德生物公司）；AF100型制冰機（意大利Scotsman公司）；電熱鼓風干燥箱（上海市儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 SMMC-7721細胞的培養(yǎng) 用含10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2以及飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細胞生長至24 h換液1次，長至密度為70%～80%時進行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 細胞增殖實驗

1.2.2.1 實驗分組 設置正常組、加藥組、5-Fu陽性對照組和DMSO陰性對照組。

1.2.2.2 細胞培養(yǎng) 取對數(shù)生長期的SMMC-7721細胞制成約1×105／ml單細胞懸液，每孔加入100 μl接種于96孔板以使每孔約2 000～5 000個細胞，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內孵育6～8 h后加含藥的培養(yǎng)基100μl，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20μl 0.5%現(xiàn)配MTT（5 mg／ml），在細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育4 h后，終止培養(yǎng)。用5 m l注射器小心吸去孔內的培養(yǎng)液，再在每孔加入150μl的DMSO溶解結晶，室溫搖床低速振蕩待結晶完全溶解后，于酶標儀490 nm波長處測吸光度（absorbance，A）值。并計算抑制率及IC50值。以空白組作為對照組，其細胞存活率為100%，其余各組按如下公式計算：存活率＝（各實驗組A值／對照組A值）×100%。重復以上實驗操作至少3次。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞周期 將細胞以1× 104／瓶接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)約12 h后加藥處理48 h，棄去培養(yǎng)液，用胰酶適度消化細胞，加入培養(yǎng)基輕輕吹打；轉速1 200 r／min離心5 min，收集細胞；用PBS洗2～3遍，加約0.5 ml的PBS緩慢吹勻細胞，離心棄上清液；加約1 ml 70%冷乙醇溶液，－20℃下固定過夜；1 200 r／min離心5 min，收集固定細胞，PBS洗2～3遍；加入碘化丙啶（100μg／m l）和RNase（50μg／ml），置于4℃下避光染色30 min，將流式細胞管中放在流式細胞儀上檢測，用ModFit軟件分析DNA倍體及細胞周期各時相，所有實驗重復至少3次。

1.2.4 端粒酶的活性檢測

1.2.4.1 細胞培養(yǎng)及細胞抽提物制備 從RPMI-1640細胞培養(yǎng)液中，收集約106個SMMC-7721細胞，放入1.5 ml的Ep管中，洗滌。4℃用離心機離心5 min（1 200 r／min）后棄除上清液，洗滌2次；然后加入200μl的CHAPS裂解液震蕩混勻后，在冰浴中靜置30 min后，再用14 000 r／min的轉速離心20 min后收集上清液，取出部分檢測蛋白濃度后保存于－80℃下。

1.2.4.2 端粒重復序列擴增程序（telomeric repeat amplification protocol，TRAP）實驗 取細胞抽提物2.0μl加入5.0μl的10×TRAPReaction buffer、1.0 μl的50×dNTPMix、1.0μl的TSPrimer、1.0μl的TRAPPrimer Mix、0.4μl的Taq Polymerase（5 U／μl）、39.6μl的dH2O共50μl。然后將PCR管置于PCR擴增儀上，30℃下靜置30 min，然后進行PCR擴增，94℃變性30 s、59℃退火30 s、72℃延伸1 min，待33個循環(huán)后，取PCR擴增產(chǎn)物25μl，利用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后將膠用EB或SYBR（10 mg／ml）染色30 min。拍照觀察結果。

1.2.5 Western blot法檢測hTERT蛋白的表達

1.2.5.1 蛋白提取 取經(jīng)給藥處理48 h后細胞，用PBS洗滌2～3次后，用吸水紙吸干PBS，在每瓶細胞加入含1%PMSF的RIPA裂解液500μl，于冰上輕輕搖晃30 min后轉移到1.5 ml的EP管中，在4℃、12 000 r／min下離心15 min后緩慢吸取上清液至新的1.5 ml EP管后用BCA法進行蛋白定量。再按4∶1的比例加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液于100℃使蛋白變性10 min。

1.2.5.2 實驗分組 設置空白對照組、陽性對照組及加藥組。

1.2.5.3 Western blot檢測實驗 將蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后用電轉移法將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜上。在常溫下用5%的脫脂奶粉將轉移后的PVDF膜封閉3 h，并用TBST緩沖液清洗3～4次，再在4℃環(huán)境下的已稀釋適當比例的一抗中孵育過夜。孵育后的PVDF膜經(jīng)TBST洗滌3～4次后在辣根過氧化物酶標記的二抗（按1∶10 000稀釋）中室溫孵育1 h，再經(jīng)TBST洗滌3～4次后用ECL發(fā)光試劑盒顯影，以β-actin為內參，以各蛋白與β-actin的光密度（optical density，OD）比值表示蛋白的相對表達量。重復實驗操作3次以上。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，根據(jù)研究目的和數(shù)據(jù)類型不同分別進行t檢驗、單因素方差分析等統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 小分子化合物的設計合成及抗癌活性篩選

2.1.1 小分子化合物的合成 基于合理的藥物分子設計的基礎，本課題組設計并合成了二氫吡唑及新型香豆素類衍生物共5個，依次命名為2-［3-甲基-1-（4-硝基苯）-4，5-二氫吡唑砜、1-甲基-2，3-吡唑酰胺、N-（2-甲氧基苯基）-2-香豆素-3-酰胺、N′，N′-二己基-2H-香豆素-3-酰胺、6，8-二溴-［3-（三氟甲基）苯基］-2-香豆素-3-酰胺，并分別用代號化合物1、2、3、4、5表示，分子結構式見圖1。

2.1.2 化合物抗癌活性篩選 半數(shù)抑制濃度（IC50）是指抑制50%細胞增殖時所使用的化合物濃度，其值越小即表明抗癌活性越高。為了觀察所合成化合物的抗癌活性，現(xiàn)采用100、20、4、0.8、0.16 μmol／L 5個濃度，在人肝癌細胞株SMMC-7721、人乳腺癌細胞株MCF-7、人胃癌細胞株SGC-7901以及人肝癌細胞株HepG2這4種細胞株上進行初篩。結果顯示，化合物1對腫瘤細胞增殖具有較好的抑制作用，尤其是對SMMC-7721細胞株體現(xiàn)出很好的抑制增殖效果。見表1。

表1 化合物1在SMMC-7721、MCF-7、SGC-7901以及HePG2細胞上的IC50值（n＝3，±s）

表1 化合物1在SMMC-7721、MCF-7、SGC-7901以及HePG2細胞上的IC50值（n＝3，±s）

細胞株IC50（μmol／L）化合物1 5-FU SMMC-7721 4.49±0.33 15.74±0.93 MCF-7 8.15±0.14 33.97±0.82 SGC-7901 58.20±1.67 38.43±1.13 HepG2 5.88±1.14 12.47±0.87

2.2 化合物1對SMMC-7721肝癌細胞增殖的抑制作用

2.2.1 MTT比色法實驗結果 通過MTT法實驗篩選出的小分子化合物1對SMMC-7721具有較強的抑制增殖的作用，與陽性對照5-FU組相比，其IC50值更低，提示化合物1對SMMC-7721具有較強的抗癌活性作用。

2.2.2 流式細胞周期實驗結果 細胞周期實驗結果顯示小分子化合物1（4.49μmol／L）處理SMMC-7721細胞48 h后，G0／G1期細胞顯著減少（F＝48.811，P＜0.05），S期顯著增多（F＝783.097，P＜0.01），提示化合物1抑制腫瘤細胞增殖，主要是通過阻滯細胞周期于S期實現(xiàn)的。見圖2。

2.3 端粒酶活性通過改良的TRAP實驗檢測SMMC-7721細胞中端粒酶活性以觀察化合物1對端粒酶活性的影響，結果顯示，化合物1表現(xiàn)出較高的端粒酶活性抑制作用，IC50值為（7.81±1.32）μmol／L，略低于陽性對照藥溴化乙錠，IC50值為（2.21±0.50）μmol／L。

2.4 化合物1對SMMC-7721細胞中hTERT表達的影響SMMC-7721在化合物1（4.49μmol／L）和AZT（陽性對照藥，20.0 mmol）處理48 h后，陽性對照藥AZT組中hTERT的表達量明顯下降（F＝530.551，P＜0.01）；化合物1組中hTERT的表達量顯著下降（F＝106.896，P＜0.01），提示化合物1對hTERT的表達具有明顯的抑制作用，見圖3。

3 討論

端粒酶自被發(fā)現(xiàn)以來，由于其在負責維持的染色體的完整性、細胞永生化以及腫瘤發(fā)生發(fā)展方面的關鍵作用而被廣泛研究［5］。因此，以端粒酶作為抗腫瘤藥物篩選的新靶點也成為了當下研究的熱點［6］。其中，作為端粒酶活性的主要限制因素之一的hTERT［7］由于其在癌細胞內高表達但在癌旁組織中表達極少而被認為更適合作為明確部位的靶點。

研究［8－9］發(fā)現(xiàn)二氫吡唑類化合物以及香豆素類衍生物是具有多種突出生物活性的先導化合物。最近同時被發(fā)現(xiàn)在抑制細胞增殖作用和潛在的抗癌活性方面具有良好的藥理學活性［10－12］。因此，在基于合理的藥物分子設計的基礎上，本研究以端粒酶hTERT蛋白的晶體結構為基礎通過計算機模擬、設計并合成一系列新型二氫吡唑類化合物和香豆素類衍生物，并對其進行抗癌活性篩選和初步藥理學作用探討。

體外抗增殖活性實驗結果表明受試的5個化合物中，以二氫吡唑為先導的化合物1體現(xiàn)出較好的抑制腫瘤細胞尤其是人肝癌細胞株SMMC-7721增殖的活性。通過進一步的流式細胞周期實驗發(fā)現(xiàn)在化合物1的作用下SMMC-7721細胞在S期細胞數(shù)目顯著增多，而在G0／G1期細胞顯著減少，提示其主要是通過將細胞阻滯在S期而發(fā)揮抑制人肝癌細胞增殖的作用。而改良的TRAP實驗顯示其對端粒酶的活性抑制作用明顯，同時Western blot法結果顯示化合物可以顯著降低hTERT蛋白的表達。

綜上所述，本課題組設計合成的化合物1通過靶向hTERT抑制端粒酶活性和hTERT蛋白表達，并阻滯細胞周期于S期，最終抑制SMMC-7721細胞增殖。這些結果對我們進一步合理優(yōu)化設計二氫吡唑類化合物以尋找更有效的端粒酶抑制劑指明了方向。然而化合物1是如何通過靶向hTERT產(chǎn)生抑制細胞增殖作用的具體藥理學機制尚不明確，仍需要進一步深入探討。

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Novel compound containing dihydropyrazolemoiety inhibits the proliferation of SMMC-7721 by targeting hTERT

He Xu1，2，3，Huang Cheng1，2，3，Meng Xiaoming1，2，3，et al
（1School of Pharmacy，Anhui Medical University，2Institute of Liver Diseases of Anhui Medical University，3Anhui Institute of Innovative Drugs，Hefei 230032）

Objective To investigate the inhibitory effect of novel compound containing dihydropyrazole moiety on the proliferation of SMMC-7721 by targeting hTERTmelittin.MethodsThe inhibition rate of proliferation of cells treated with novel compoundswasmeasured by MTTassay.And the novel compounds’effecton cell cycle was tested by flow cytometry cell cycle experiment.Telomerase activity was determined throughmodified Telomeric Repeat Amplification Protocol（TRAP）assays.The protein expression level of hTERT was observed by Western blot.ResultsCompared with the heterocyclic compounds，novel compound containing dihydropyrazolemoiety had obvious inhibitory effect on the proliferation of cell lines，especially on the human hepatoma cell line SMMC-7721.The result of flow cytometric cell cycle analysis showed that the number of cells in Sphase wasmarkedly increased.After the treatmentwith novel compound containing dihydropyrazolemoiety，the results ofmodified TRAP assays predicted that the telomerase activity was inhibited.And the results ofwestern blot showed that the protein expression level of hTERT decreased obviously.ConclusionNovel compound containing dihydropyrazolemoiety inhibits the proliferation of SMMC-7721 andmakes them arrested at S phase.This initial discovery ismainly achieved through the inhibition of telomerase activity by targeting hTERT.

dihydropyrazole；coumarin；human hepatoma cell line SMMC-7721；proliferation inhibition；hTERT

R 962

A

1000－1492（2015）08－1053－05

2015－04－14接收

安徽省科技攻關計劃項目（編號：1301042212）

1安徽醫(yī)科大學藥學院，2安徽醫(yī)科大學肝病研究所，3安徽省高校產(chǎn)業(yè)共性技術研究院，合肥 230032

何 旭，女，碩士研究生；

李 俊，男，博士，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：lj＠ahmu.edu.cn