常坤鵬，丁小靈，王取南，夏 新

激肽原酶對(duì)大腦中動(dòng)脈缺血大鼠CGRP、RAMP1及VEGF表達(dá)的影響

常坤鵬1，丁小靈1，王取南2，夏 新2

目的研究激肽原酶預(yù)處理對(duì)腦缺血大鼠降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、受體活性修飾蛋白1（RAMP1）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)的影響。方法將80只大鼠隨機(jī)均分成4組，假手術(shù)組（S組）、腦缺血組（I組）、激肽原酶低劑量組（3.75×10－3PNA單位／（kg·d），I＋Kal1組）、激肽原酶高劑量組（17.25×10－3PNA單位／（kg·d），I＋Kal2組）。經(jīng)尾靜脈注射給藥1周后，采用線(xiàn)栓法堵塞大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈，建立右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血模型。術(shù)后24 h紅四氮唑法測(cè)量腦梗死體積，使用免疫組化和Western blot法觀察CGRP蛋白在海馬組織內(nèi)的表達(dá)及RAMP1和VEGF蛋白在皮層組織內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果與S組相比，I組大鼠腦組織CGRP、RAMP1及VEGF蛋白水平表達(dá)增加（P＜0.01）；與I組相比，激肽原酶高、低劑量能明顯促進(jìn)腦缺血大鼠腦組織CGRP、RAMP1及VEGF蛋白的表達(dá)（P＜0.05），腦梗死體積縮?。≒＜0.05）。結(jié)論激肽原酶促進(jìn)缺血腦組織內(nèi)CGRP、RAMP1蛋白的表達(dá)，CGRP、RAMP1的表達(dá)可能與腦梗死后血管新生有相關(guān)性。

降鈣素基因相關(guān)肽；受體活性修飾蛋白1；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；激肽原酶；缺血性腦卒中；大鼠

降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）是一個(gè)廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的辣椒素敏感感覺(jué)神經(jīng)的重要肽類(lèi)遞質(zhì)。新近研究［1］顯示，CGRP還具有顯著地促進(jìn)血管生成的作用，此作用可能與CGRP激活了內(nèi)皮細(xì)胞的AMPK-eNOS途徑有關(guān)。CGRP的生理作用主要通過(guò)其受體發(fā)揮，而受體活性修飾蛋白1（receptor activitymodifying protein 1，RAMP1）通過(guò)調(diào)節(jié)降鈣素受體樣受體（Calcitonin receptor-like receptor，CRLR）與配體結(jié)合，從而決定和調(diào)節(jié)CGRP的受體活性［2］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種具有內(nèi)皮細(xì)胞特異性的有絲分裂原，隨著相關(guān)研究的不斷深入，VEGF的表達(dá)水平已被作為血管新生能力的標(biāo)志。該實(shí)驗(yàn)采用大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血模型，觀察不同劑量激肽原酶對(duì)大鼠腦缺血后腦梗死體積、VEGF蛋白及促進(jìn)血管新生因子CGRP、RAMP1表達(dá)的影響情況，探討CGRP、RAMP1與缺血性腦卒中后梗死灶周?chē)苄律南嚓P(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠80只，250～300 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠的飼養(yǎng)和各種操作均在同一動(dòng)物中心和實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，SPF級(jí)飼料產(chǎn)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)（德國(guó)VarioCam公司冷凍圖像攝入系統(tǒng)及其分析軟件）；Power-Pac HC型電泳儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）；全自動(dòng)計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)（KONTRON IBAS 2.5，德國(guó)VarioCam公司）

1.1.3 主要試劑 激肽原酶（廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司）；兔抗大鼠CGRP、RAMP1、VEGF、βaction單克隆一抗（英國(guó)Abcam公司）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天公司）；蛋白抽提試劑盒及蛋白Marker（美國(guó)Fermentas公司）；紅四氮唑（美國(guó)Sigma公司）；PVDF膜（美國(guó)法瑪西亞公司）；ECL試劑盒（美國(guó)Thermo公司）；免疫組化試劑盒、免疫組化用生物素標(biāo)記山羊抗兔二抗、DAB顯色劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腦缺血模型的制備 用線(xiàn)栓栓塞法制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血模型，手術(shù)成功后注意保暖，單籠飼養(yǎng)觀察。術(shù)后24 h按照Longa神經(jīng)行為缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，選擇符合實(shí)驗(yàn)條件的大鼠，剔除不合格者，試驗(yàn)中隨機(jī)補(bǔ)充，保證每組動(dòng)物數(shù)不變。

1.2.2 動(dòng)物分組 將80只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（S組）、腦缺血組（I組）、激肽原酶低劑量組（3.75 ×10－3PNA單位／（kg·d），I＋Kal1組）、激肽原酶高劑量組（17.25×10－3PNA單位／（kg·d），I＋Kal2組）。

1.2.3 給藥方式和藥物劑量 藥物采用尾靜脈注射方式給予（灌胃給藥無(wú)效）。激肽原酶預(yù)處理組連續(xù)給藥6 d，每天1次，手術(shù)前30 min再給1次藥。同時(shí)，S組、I組予以同等劑量0.9%氯化鈉溶液處理。激肽原酶劑量按如下處理：激肽原酶低劑量組（3.75×10－3PNA單位／（kg·d），I＋Kal1組）、激肽原酶高劑量組（17.25×10－3PNA單位／（kg·d），I＋Kal2組）。

1.2.4 紅四氮唑法測(cè)定腦梗死體積 在大鼠腦缺血后24 h，水合氯醛麻醉，迅速斷頭取腦。將大腦放置于大鼠腦切片模具中，每隔2 mm作冠狀切片，將腦切片置于2%紅四氮唑中，37℃避光孵育30 min，然后用4%多聚甲醛溶液固定。正常腦組織染成玫瑰紅色，缺血腦組織呈白色。腦切片按順序排列整齊后拍照。將梗死組織和正常組織分別稱(chēng)重。腦梗死體積百分比由腦梗死計(jì)算公式計(jì)算得出：腦梗死體積（%）＝白色腦組織重量／（白色腦組織重量＋玫瑰紅色腦組織重量）×100%。

1.2.5 免疫組化檢測(cè)CGRP、RAMP1及VEGF蛋白的表達(dá) 大鼠腦缺血模型制備成功后，經(jīng)心臟灌注固定大鼠，然后斷頭取腦，置于4%多聚甲醛液固定約24 h。然后進(jìn)行乙醇梯度脫水、石蠟包埋、制成厚度為5μm切片。選取海馬部位組織切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)CGRP蛋白；視選擇交叉部位組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)RAMP1及VEGF蛋白。具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。隨機(jī)選擇5個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞分布區(qū)非重疊的高倍鏡視野，用陽(yáng)性率公式計(jì)算CGRP、RAMP1及VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.2.6 Western blot檢測(cè)CGRP、RAMP1及VEGF蛋白表達(dá) 各組分別在大鼠腦缺血模型制備成功24 h后，取右損傷側(cè)大腦海馬或者皮質(zhì)組織，裂解、研磨、離心，取上清液。然后配置膠液體，進(jìn)行電泳，濕法轉(zhuǎn)膜、洗膜，再加入CGRP、RAMP1及VEGF一抗（1∶1 000稀釋?zhuān)┗颚?actin（1∶1 000稀釋?zhuān)?，孵育過(guò)夜。加二抗，室溫孵育2 h后洗膜，再加入ECL檢測(cè)試劑，X線(xiàn)片曝光、顯影、定影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（F檢驗(yàn)），兩兩比較采用SNK方法。

2 結(jié)果

2.1 激肽原酶對(duì)腦缺血大鼠腦梗死體積的影響紅四氮唑染色后的腦切片，非梗死區(qū)呈玫瑰紅色，梗死區(qū)呈白色。S組無(wú)腦梗死；與S組相比，I組、I＋Kal1組、I＋Kal2組梗死體積為（27.19±0.80）%、（25.22±1.61）%、（14.14±0.80）%，缺血側(cè)腦組織有明顯的梗死（P＜0.01，F(xiàn)＝190.56）；與I組相比，I＋Kal1組腦梗死體積明顯縮?。≒＜0.05），I＋Kal2組腦梗死體積縮小更明顯（P＜0.01）。

2.2 免疫組化檢測(cè)激肽原酶對(duì)大鼠腦缺血后CGRP、RAMP1及VEGF蛋白含量表達(dá)的影響CGRP蛋白陽(yáng)性表達(dá)位于海馬區(qū)細(xì)胞質(zhì)，RAMP1及VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)位于大腦皮層細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。各組指標(biāo)采用單因素方差分析進(jìn)行主體間的效應(yīng)檢驗(yàn)（FCGRP＝496.64，F(xiàn)RAMP1＝839.73，F(xiàn)VEGF＝807.09，P＜0.01）。SNK兩兩比較結(jié)果顯示，S組腦組織有少量陽(yáng)性細(xì)胞CGRP（11.05±2.10）個(gè)，RAMP1（7.03±1.16）個(gè)，VEGF（9.24±2.03）個(gè)。與S組比較，I組大鼠海馬區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞CGRP（43.37±3.07）個(gè)，RAMP1（27.02±2.31）個(gè)，VEGF（32.27±1.32）個(gè)，數(shù)量明顯增加（P＜0.01），與I組比較，I＋Kal1組CGRP（62.09±3.57）個(gè)，RAMP1（51.04±2.34）個(gè)，VEGF（54.21±1.46）個(gè)及I＋Kal2組CGRP（85.29±3.57）個(gè)，RAMP1（64.87±2.03）個(gè)，VEGF（71.36±3.05）個(gè)，陽(yáng)性細(xì)胞逐漸升高（P＜0.05），其中以I＋Kal2組升高最為明顯（P＜0.01）。見(jiàn)圖1～3。

2.3 Westernblot檢測(cè)激肽原酶對(duì)大鼠局灶性腦缺血后腦CGRP及RAMP1蛋白含量表達(dá)的影響

各組指標(biāo)采用單因素方差分析進(jìn)行主體間的效應(yīng)檢驗(yàn)，結(jié)果顯示FCGRP＝215.40，F(xiàn)RAMP1＝166.71，F(xiàn)VEGF＝64.06，P＜0.01。SNK兩兩比較結(jié)果顯示，S組腦組織有少量CGRP、RAMP1及VEGF蛋白表達(dá)，與S組相比，I組CGRP、RAMP1及VEGF蛋白表達(dá)明顯高于S組（P＜0.01）；與I組相比，I＋Kal1組和I＋Kal2組CGRP、RAMP1及VEGF逐漸升高（P＜0.05），其中以I＋Kal2組升高最為明顯（P＜0.01）。見(jiàn)圖4、5。

3 討論

缺血性腦卒中發(fā)生時(shí)，大腦會(huì)通過(guò)其側(cè)枝循環(huán)進(jìn)行代償。梗死灶周?chē)律埽ǖ谌?jí)側(cè)枝循環(huán)）的密度與缺血性腦卒中患者的預(yù)后直接相關(guān)，新生的腦血管可能為神經(jīng)元存活提供營(yíng)養(yǎng)［3］并促進(jìn)腦損傷的恢復(fù)［4］。激肽原酶屬絲氨酸蛋白酶超家族中的一員，相對(duì)分子質(zhì)量約54 000，已被確定為新的血管生成因子。激肽原酶能切割低分子量激肽原，釋放血管活性肽—激肽，激肽與高親和力的B1／B2受體結(jié)合，促進(jìn)新生血管的形成，改善腦組織的葡萄糖和氧的攝取，加快神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)和縮小腦梗死范圍［5］。

卒中發(fā)生后，缺血半暗帶區(qū)會(huì)產(chǎn)生大量VEGF等與血管新生有關(guān)的生長(zhǎng)因子，促進(jìn)血管新生［6］。有研究［7］表明，缺血、缺氧條件可激活血管內(nèi)皮出芽式血管新生的發(fā)生，而且VEGF可促進(jìn)卒中后出芽式血管新生。另外，在缺氧條件下，VEGF還可作為一種內(nèi)源性多效性生長(zhǎng)因子，對(duì)腦梗死后的神經(jīng)血管重塑及血管形成有促進(jìn)作用［8］。隨著研究的深入，VEGF表達(dá)的水平代表了新生血管潛能。本研究給予激肽原酶預(yù)處理后大鼠大腦皮層VEGF蛋白表達(dá)升高。與S組比較，I組大鼠腦組織VEGF水平表達(dá)增加。與I組比較，I＋Kal1組及I＋Kal2組大鼠腦組織VEGF水平明顯增加，其中以I＋Kal2組大鼠腦組織VEGF水平增高最為明顯。從而間接證實(shí)激肽原酶能促進(jìn)缺血性腦卒中后血管新生。

CGRP存在功能的多樣性，新近研究證實(shí)CGRP還具有介導(dǎo)血管新生的作用。沙土鼠腦缺血再灌注研究［9］顯示CGRP具有增加腦血流量和神經(jīng)保護(hù)雙重功能。研究［10］表明，內(nèi)源性CGRP對(duì)肢體缺血小鼠模型的再血管化有促進(jìn)作用。本研究中給予激肽原酶后，出現(xiàn)CGRP蛋白表達(dá)升高。與S組相比，I組大鼠腦組織CGRP表達(dá)水平增加，提示腦缺血本身就是促進(jìn)CGRP表達(dá)的因素，腦梗死發(fā)生后通過(guò)機(jī)體自身調(diào)節(jié)而促進(jìn)CGRP的表達(dá)。與I組比較，I＋Kal1組及I＋Kal2組大鼠腦組織CGRP水平逐漸增加，其中以I＋Kal2組大鼠腦組織CGRP水平增高最為明顯。此結(jié)果表明激肽原酶能促進(jìn)CGRP在腦缺血模型大鼠腦組織中的表達(dá)，且其表達(dá)升高水平與VEGF在腦組織表達(dá)水平基本一致，而VEGF的水平代表了新生血管水平。從而間接證明CGRP與缺血性腦卒中后血管的新生有一定相關(guān)性。

CGRP的生物學(xué)作用并非僅取決于其本身，還與CGRP受體以及某些與受體相互作用的調(diào)節(jié)蛋白有關(guān)。大量研究［11］表明，CGRP是通過(guò)其關(guān)鍵受體亞單位—RAMP1發(fā)揮作用的，RAMP1不僅決定了CGRP的受體活性及生物學(xué)作用，可能還是CGRP受體發(fā)揮作用的限速蛋白。另有研究［12－13］顯示，RAMP1可調(diào)節(jié)CRLR與配體的結(jié)合，從而決定了配體的受體表型及作用強(qiáng)弱。但是，RAMP1是否參與缺血性腦卒中后血管新生的過(guò)程，尚不清楚。推測(cè)CGRP是通過(guò)RAMP1參與缺血性腦卒中后血管新生的過(guò)程，即RAMP1也與缺血性腦卒中后血管新生有相關(guān)性。本研究表明，與S組相比，I組RAMP1升高，與I組比較，I＋Kal1組及I＋Kal2組大鼠腦組織RAMP1表達(dá)水平逐漸增加，其中以I＋Kal2組大鼠腦組織RAMP1水平增高最為明顯。說(shuō)明激肽原酶促進(jìn)RAMP1在腦缺血大鼠腦組織的表達(dá)，同時(shí)VEGF表達(dá)水平明顯升高、腦梗死體積也縮小，表明RAMP1與缺血性腦卒中后血管新生有相關(guān)性。

［1］ Mishima T，Ito Y，Hosono K，et al.Calcitonin gene-related peptide facilitates revascularization during hindlimb ischemia in mice［J］.Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2011，300（2）：H431－9.

［2］ Kuwasako K，Kitamura K，Nagata S，etal.Function of the cytoplasmic tail of human calcitonin receptor-like receptor in complex with receptor activity-modifying protein 2［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，392（3）：380－5.

［3］ Font M A，Arboix A，Krupinski J，Angiogenesis，neurogenesis and neuroplasticity in ischemic stroke［J］.Curr Cardiol Rev，2010，6（3）：238－44.

［4］ Zan L，Wu H，Jiang J，et al.Temporal profile of Src，SSeCKS，and angiogenic factors after focal cerebral ischemia：correlations with angiogenesis and cerebraledema［J］.Neurochem Int，2011，58（8）：872－9.

［5］ 劉平平，蘇賜力，王燕宏.尤瑞克林治療急性期腦梗死的療效及血清CRP的變化［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)刊，2013，40（5）：11－2.

［6］ Liman T G，Endres M.New vessels after stroke：postischemic neovascularization and regeneration［J］.Cerebrovasc Dis，2012， 33（5）：492－9.

［7］ Oladipupo S，Hu S，Kovalski J，et al.VEGF is essential for hypoxia-inducible factor-mediated neovascularization but dispensable for endothelial sprouting［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（32）：13264－9.

［8］ Ma Y，LiuW，Wang Y，etal.VEGF protects rat cortical neurons from mechanical trauma injury induced apoptosis via the MEK／ERK pathway［J］.Brain Res Bull，2011，86（5－6）：441－6.

［9］ Feng G，Xu X，Wang Q，et al.The protective effects of calcitonin gene-related peptide on gastricmucosa injury after cerebral ischemia reperfusion in rats［J］.Regul Pept，2010，160（1-3）：121－8.

［10］Zheng S，LiW，Xu M，etal.Calcitonin gene-related peptide promotes angiogenesis via AMP-activated protein kinase，American journal of physiology［J］.Am JPhysiol Cell Physiol，2010，299（6）：C1485－92.

［11］Maemondo M，Inoue A，Kobayashi K，et al.Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer withmutated EGFR［J］.N Engl JMed，2010，362（25）：2380－8.

［12］Koth C M，Abdul-Manan N，Lepre C A，et al.Refolding and characterization of a soluble ectodomain comp lex of the calcitonin gene-related peptide receptor［J］.Biochemistry，2010，49（9）：1862－72.

［13］Barwell J，Miller P S，Donnelly D，et al.Mapping interaction sites within the N-terminus of the calcitonin gene-related peptide receptor；the role of residues 23-60 of the calcitonin receptor-like receptor［J］.Peptides，2010，31（1）：170－6.

Effect of human urinary kallidinogenase on expression of CGRP，RAMP1 and VEGF in rats suffered focal cerebral ischem ia

Chang Kunpeng1，Ding Xiaoling1，Wang Qunan2，etal
（1Dept of Neurology Disease，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001；2Dept of Toxicology，School of Public Health，AnhuiMedical University，Hefei 230032）

Objective To study the effect of human urinary kallidinogenase on expression of CGRP，RAMP1 and VEGF in rats suffered focal cerebral ischemia.Methods80male SD ratswere randomly divided into four groups：sham operation group（S group），ischemia group（Igroup），low dose of kallidinogenase（3.75×10－3PNA／（kg ·d），I＋Kal1group）and high dose of kallidinogenase（17.25×10－3PNA／（kg·d），I＋Kal2group）.Each group had 20 rats.Themethod of line bolt blocks the rightmiddle cerebral artery in ratswas used to establish the right MCAO ischemiamodel after tail intravenous dosing 1 week.TTCmethod was used tomeasure the cerebral infarction volume.Immunohistochemistry and Western blotwere used to evaluate the expression of CGRP protein in the hippocampus and the expression of RAMP1 and VEGF protein in the cerebral cortex.ResultsCompared with the Sgroup，the expression of CGRP，RAMP1 and VEGF increased significantly in the Igroup rats（P＜0.01）. While，compared with the I group，kallidinogenase high and low dose group can significantly reduce cerebral infarction and markedly increase the expression ofCGRP，RAMP1 and VEGF induced in cerebral ischemia24 h after MCAO（P＜0.05）.ConclusionHuman urinary kallidinogenase can promote the expression of CGRP and RAMP1 in ischemic brain tissues and thismay be one of themechanisms of promoting angiogenesis after cerebral infarction.

CGRP；RAMP1；VEGF；human urinary kallidinogenase；cerebral ischemia；rat

R 743.3

A

1000－1492（2015）08－1063－05

2015－03－20接收

安徽省年度重點(diǎn)科研項(xiàng)目（編號(hào)：1301043017）

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，合肥 230001

2安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理系，合肥 230032

常坤鵬，男，碩士研究生；

丁小靈，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：merryding＠163.com