張燕青，陳錦珊，李金雨，林秀麗，石鶴坤，林小鳳（解放軍175醫(yī)院，．藥學(xué)科；．泌尿外科，福建漳州363000）

MDR1基因多態(tài)性和單倍體對腎移植術(shù)后穩(wěn)定期患者他克莫司濃度／劑量比值的影響

張燕青a，陳錦珊a，李金雨b，林秀麗a，石鶴坤a，林小鳳a（解放軍175醫(yī)院，a．藥學(xué)科；b．泌尿外科，福建漳州363000）

目的探討MDR1 C1236T、G2677T／A和C3435T基因多態(tài)性和單倍體對中國漢族腎移植術(shù)后穩(wěn)定期患者他克莫司濃度／劑量比值的影響，為他克莫司個體化用藥提供依據(jù)。方法采用PCR-基因測序法檢測104例腎移植術(shù)后穩(wěn)定期患者M(jìn)DR1 C1236T、G2677T／A和C3435T的基因多態(tài)性，采用均相酶免疫測定方法（EM IT法）測定他克莫司的谷濃度，比較不同基因型患者之間他克莫司血藥濃度／（劑量×體質(zhì)量）（C／D）比值。結(jié)果104例患者中，MDR1 C1236T、G2677T／A和C3435T突變頻率分別為56．73%、55．77%和33．17%。MDR1 C3435T、MDR1 TTT單倍體與他克莫司C／D比值具有相關(guān)性（P＜0.05）。CYP3A5*3*3患者中，MDR1 TTT單倍體與他克莫司C／D比值仍存在顯著相關(guān)（P＜0.05）。MDR1 C1236T、G2677T／A、CGC單倍體與他克莫司C／D比值無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論MDR1 C3435T、MDR1 TTT單倍體與中國漢族腎移植術(shù)后穩(wěn)定期患者他克莫司C／D比值具有顯著相關(guān)性，是影響腎移植患者他克莫司濃度個體化差異的重要因素。

腎移植；他克莫司；多藥耐藥基因；基因多態(tài)性；單倍體

腎移植術(shù)后患者需要長期甚至終身接受免疫抑制劑治療，其中鈣調(diào)磷酸酶抑制劑他克莫司（FK-506）已逐漸取代環(huán)孢素（CsA），成為預(yù)防和治療腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)的首選藥物［1，2］。研究表明，他克莫司血藥濃度與排斥反應(yīng)和毒副作用密切相關(guān)［3］。

藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體P-糖蛋白（P-gp）是多藥耐藥基因1（multidrug resistance 1，MDR1）編碼的產(chǎn)物，主要作用是能量依賴性地將作用底物由細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜外，其基因多態(tài)性會影響P-gp的活性和功能。他克莫司是P-gp的底物，編碼P-gp的基因表現(xiàn)高度多態(tài)性，不同的基因變異攜帶者對他克莫司的代謝和療效具有重要影響［4］。在已發(fā)現(xiàn)的48個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）中，外顯子21、26和12的G2677T／A、C3435T和C1236T SNP具有重要的功能意義，且它們之間有一定的連鎖，其連鎖程度在不同種族間差異很大。本研究旨在考察MDR1（G2677T／A、C3435T和C1236T）多態(tài)性和單倍體對中國漢族腎移植術(shù)后穩(wěn)定期患者他克莫司血藥濃度／（劑量×體質(zhì)量）（C／D）的影響，進(jìn)而探討基因多態(tài)性與藥效的關(guān)系，為臨床個體化給藥提供參考。

1 試劑與儀器

他克莫司檢測試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑盒和質(zhì)控試劑盒（Siemens Healthcar Diagnostics Inc．）；人血基因組DNA提取試劑盒（Omega）；引物合成和PCR產(chǎn)物基因測序由華大基因科技有限公司完成；Viva-E型藥物濃度分析儀（德國西門子）；高速離心機(jī)（美國Thermo）；PCR儀（杭州博日）。

2 方法

2．1研究對象 選擇2013年6月至2014年12月在解放軍175醫(yī)院門診復(fù)診的采用他克莫司＋嗎替麥考酚酯＋糖皮質(zhì)激素三聯(lián)免疫抑制抗排斥的漢族腎移植術(shù)后穩(wěn)定期（＞6個月）受者104例，均簽訂知情同意書。其中，男75例，女29例，年齡17～65（43．3±10．7）歲，體質(zhì)量42～87（59．9±10．7）kg。排除標(biāo)準(zhǔn)：①移植腎功能正常，血清肌酐＞300μmol／L；②因感染等因素使用與他克莫司存在相互作用的藥物，尤其是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素及酮康唑、氟康唑、克霉唑等抗真菌藥物；③需服用與他克莫司存在相互作用的利福平的結(jié)核病患者；④服用葡萄柚汁及地爾硫 、硝苯地平、五酯制劑等食物或藥物以提高他克莫司濃度的受者。

2．2觀察指標(biāo)

2．2．1 臨床指標(biāo) 收集入選患者的性別、年齡、身高、體質(zhì)量、服藥量、激素劑量、合并用藥、血脂、紅細(xì)胞比容、血清白蛋白、肝功能等指標(biāo)。

2．2．2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)①他克莫司全血谷濃度測定：對入選患者嚴(yán)格規(guī)范服藥時間和采血時間，前1日晚20：00服用他克莫司，次日晨8：00服藥前抽血2 m l，加入EDTA抗凝備用，測定他克莫司全血谷濃度。②C1236T和G2677T／A、C3435T基因分型檢測：采用Omega血液基因組DNA提取試劑盒，按照說明書提取DNA。采用基因測序法對C1236T和G2677T／A、C3435T進(jìn)行基因分型，擴(kuò)增引物見表1，測序圖譜見圖1。實(shí)驗(yàn)條件：○i反應(yīng)體系：DNA樣本1μl，前后引物各1μl，KAPA2G Fast M ultiplex M ix 12．5μl，水9．5μl?！餴i反應(yīng)程序：94℃5 m in；94℃30 s，60℃30 s，72℃90 s，30次循環(huán)；72℃5 min。

表1 C1236T和G2677T／A、C3435T等位基因擴(kuò)增引物

圖1 MDR1 C3435T PCR產(chǎn)物測序圖

2．3統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 20．0軟件和SHEsis在線平臺（http：／／analysis．bio-x．cn／myAnalysis．php）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，顯著性水平為P≤0.05；檢測樣本等位基因頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律采用卡方（χ2）檢驗(yàn)；血藥濃度數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性分析，符合正態(tài)分布，不同基因型的他克莫司濃度／（劑量×體質(zhì)量）的比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析（ANOVA）。

3 結(jié)果

3．1MDR1 C1236T、G2677T／A和C3435T等位基因頻率 104例漢族腎移植患者M(jìn)DR1 C1236T、G2677T／A和C3435T基因型頻率和等位基因頻率見表2，突變頻率分別為56．73%、55．77%和33.17%。對基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)（P＞0．05），表明研究資料具有群體代表性。

表2 104例漢族腎移植患者M(jìn)DR1 C1236T、G2677T／A和C3435T基因頻率

采用SHEsis在線平臺分析連鎖不平衡關(guān)系，結(jié)果顯示，G2677T／A與C3435T、C1236T與C3435T、G2677T／A與C1236T之間標(biāo)準(zhǔn)化的連鎖不平衡系數(shù)D’和相關(guān)系數(shù)r2分別為D’＝0．955，r2＝0．48；D’＝0．585，r2＝0．129；D’＝0．378，r2＝0.078。研究結(jié)果表明，G2677T／A與C3435T、C1236T與C3435T存在一定程度的連鎖。對MDR1單倍體進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)了4種主要單倍體和6種次要單倍體。4種主要單倍體為：TTT（27.3%）、CGC（22%）、TGC（21.3%）、CAC（14.7%），6種次要單倍體共占14．7%。54．8%（57／104）患者的G2677T／A與C3435T為單倍體連鎖；24．04%（25／104）患者的C1236T、G2677T／A和C3435T為單倍體連鎖。

3．2MDR1基因多態(tài)性對他克莫司C／D比值的影響 根據(jù)給藥劑量和體質(zhì)量將血藥濃度標(biāo)準(zhǔn)化，以觀察MDR1基因多態(tài)性對血藥濃度的影響。結(jié)果顯示（表3），MDR1 C1236T和MDR1 G2677T／A各組之間比較無顯著差異（P＞0．05），表明MDR1 C1236T和MDR1 G2677T／A對腎移植術(shù)后穩(wěn)定期患者他克莫司的C／D值無明顯影響；MDR1 3435 CC型C／D比值明顯低于CT＋TT型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

3．3MDR1單倍體對他克莫司C／D比值的影響 根據(jù)連鎖不平衡分析結(jié)果，對MDR1主要單倍體TTT和CGC與他克莫司的C／D比值進(jìn)行研究，結(jié)果見表4。TTT型攜帶者與非攜帶者他克莫司的C／D比值存在顯著性差異（P＜0．05），而CGC型攜帶者與非攜帶者他克莫司的C／D比值無明顯差異（P＞0．05）。他克莫司是CYP3A酶和P-gp的共同底物。P-gp的活性可調(diào)整CYP3A5酶對他克莫司的代謝，故選擇不表達(dá)CYP3A5酶即CYA5*3 *3患者評價(jià)P-gp獨(dú)立的功能。對65例CYA5*3 *3基因型患者進(jìn)行MDR1單倍體分析，結(jié)果TTT型攜帶者他克莫司的C／D比值顯著高于非TTT型攜帶者（P＜0．05，表5）。

表3 MDR1基因多態(tài)性對他克莫司C／D值的影響

表4 MDR1單倍體對他克莫司C／D值的影響

表5 攜帶CYA5*3*3的MDR1單倍體對他克莫司C／D值的影響

4 討論

他克莫司在藥動學(xué)和毒理學(xué)方面存在明顯的個體差異，且治療窗窄，如果用藥不當(dāng)極易引起排斥反應(yīng)或腎毒性等不良反應(yīng)，因此穩(wěn)態(tài)的靶血藥濃度對保證腎移植術(shù)后的療效和移植患者的存活率極為重要。研究表明，遺傳因素是他克莫司血藥濃度個體差異的重要原因。因此，研究MDR1多態(tài)性和單倍體對他克莫司C／D比值的影響，能為腎移植患者他克莫司個體化給藥提供依據(jù)。國內(nèi)在他克莫司與藥物基因組學(xué)的研究中，入選患者未排除服用五酯制劑對他克莫司血藥濃度的影響［5-7］，本研究嚴(yán)格排除服用五酯制劑等藥物的病例，較客觀地反應(yīng)了腎移植術(shù)后穩(wěn)定期患者血藥濃度個體化差異的藥物基因組學(xué)因素。本研究中基因分型方法采用直接測序法，該方法是基因突變檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，具有準(zhǔn)確性高、方法簡單快捷等優(yōu)點(diǎn)。

本研究中104例腎移植患者的MDR1 C1236T、G2677T／A和C3435T等位基因突變頻率均達(dá)到遺傳平衡，與文獻(xiàn)報(bào)道的中國漢族人群各位點(diǎn)突變頻率基本一致［8］。G2677T／A與C3435T存在較強(qiáng)的連鎖，C1236T與C3435T存在一定程度的連鎖，與文獻(xiàn)報(bào)道基本吻合［9］。TTT單倍體的頻率為27.3%，說明突變單倍體在中國漢族人群中頻率較高。

研究結(jié)果顯示，MDR1 C1236T、G2677T／A與腎移植術(shù)后穩(wěn)定期患者的他克莫司C／D比值無顯著相關(guān)，C3435T與他克莫司C／D比值存在顯著相關(guān)性，突變型患者C／D比值較野生型患者高，即MDR1 C3435T野生型腎移植患者可能需要服用較高劑量的他克莫司才能達(dá)到治療靶濃度，與Wu等［10］的研究結(jié)果一致。MDR1 C3435T基因突變降低了P-gp活性，主動將藥物泵出細(xì)胞外的能力下降，進(jìn)而表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度高于野生型患者。這提示MDR1 C3435T基因多態(tài)性可能是他克莫司藥動學(xué)個體差異的重要原因。但也有研究發(fā)現(xiàn)MDR1 C3435T基因多態(tài)性與他克莫司C／D比值無相關(guān)性［11，12］。因MDR1 C1236T、G2677T／A和C3435T存在連鎖不平衡，對他克莫司的藥動學(xué)影響較復(fù)雜，采用單倍體分析可能更好地解釋他克莫司血藥濃度的差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，MDR1基因TTT單倍體與他克莫司血藥濃度具有顯著相關(guān)性；排除CYP3A5*3多態(tài)性對P-gp活性的影響，CYA5*3*3基因型患者中，TTT單倍體與他克莫司血藥濃度仍存在顯著相關(guān)。而MDR1基因CGC單倍體對他克莫司血藥濃度無影響。攜帶TTT單倍體患者他克莫司C／D比值顯著高于非攜帶者，表明攜帶TTT單倍體患者僅需服用較低劑量的他克莫司，便可達(dá)到有效的血藥濃度，與Cusinato等［13］的研究結(jié)果相近。攜帶TTT單倍體患者比攜帶單個突變位點(diǎn)的P-gp活性更低，主動轉(zhuǎn)運(yùn)藥物能力更弱，進(jìn)一步解釋了TTT單倍體患者具有較高的他克莫司C／D比值。

綜上所述，MDR1 C3435T和TTT單倍體與腎移植術(shù)后穩(wěn)定期患者他克莫司C／D比值具有顯著相關(guān)性。MDR1 C3435T和TTT單倍體是中國漢族腎移植人群穩(wěn)定期他克莫司藥動學(xué)的主要影響因素之一，故臨床上使用他克莫司時不僅需考慮MDR1 C3435T，還要結(jié)合單倍體對他克莫司濃度的影響，綜合分析MDR1多態(tài)性對他克莫司血藥濃度的影響。

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Influence ofmultidrug resistant gene polymorphisms and haplotype on blood concentration of tacrolimus in individuals in stable phases after renal transplantation

ZHANG Yanqinga，CHEN Jinshana，LI Jinyub，LIN Xiulia，SHI Hekuna，LIN Xiaofenga（No．175 Hospital of PLA，a．Department of Pharmacy，b．Department of Urology，Zhangzhou 363000，China）

ObjectiveTo study the relevance between the polymorphisms and haplotype of multidrug resistant gene（MDR1）and the ratio of blood concentration／dosage in individuals treated by tacrolimus in stable phases post renal transplantation，and to provide data for personalized FK-506 adm inistration．MethodsThe MDR1 C1236T，G2677T／A and C3435T genotypes of 104 renal transplantation patientswere determined by PCR followed sequencingmethod．The blood concentration of tacrolimus was detected by EM IT method．The differences in concentration／（dose×weight）（C／D）ratios were compared among all of the genotype groups treated by tacrolimus．ResultsIn the 104 renal transplantation recipients，the frequency of MDR1 C1236T，G2677T／A and C3435T mutation alleles was 56．73%，55．77%and 33．17%，respectively．A correlation was revealed among SNP of MDR1 C3435T，TTT haplotype and the C／D ratios（P＜0.05）．In patients of CYP3A5*3*3，A correlation was also found among TTT haplotype and the C／D ratios（P＜0.05）．No difference was found among the MDR1 C1236T，G2677T／A，CGC haplotype and the C／D ratios（P＞0.05）．ConclusionIt is demonstrated that genetic polymorphisms of MDR1 C3435T and TTT haplotype are correlated with C／D ratio of tacrolimus in Chinese renal transplant patients in stable stage．These findings affect the dose-adjusted concentration of tacrolimus individually．

renal transplantation；tacrolimus；MDR1；polymorphisms；haplotype

R979．5

A

1006-0111（2015）05-0415-04

10．3969／j．issn．1006-0111．2015．05．008

2015-03-09

2015-07-06

［本文編輯］ 李睿旻

漳州市科學(xué)技術(shù)局科研課題（ZZ2012J27）

張燕青，碩士，藥師．研究方向：臨床藥學(xué)．Tel：（0596）2975804；E-mail：yanqing0108＠163．com

陳錦珊，主管藥師．研究方向：醫(yī)院藥學(xué)、臨床藥學(xué)．Tel：（0596）2975795；E-mail：cjs1223＠sohu．com