董兵　余裕強(qiáng)　李顯赫　李智鵬　宮鵬濤　李建華　張西臣

摘 要：為了建立鹿人五毛滴蟲巢式PCR檢測方法并進(jìn)行驗證，根據(jù)人五毛滴蟲18S rRNA基因的特異性片段設(shè)計巢式PCR特異性引物，對兩輪PCR反應(yīng)的退火溫度和反應(yīng)體系中Mg2+濃度進(jìn)行探索和優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過靈敏性和特異性的檢測。采用建立的巢式PCR檢測方法對68份鹿糞便樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，建立的巢式PCR方法，第一輪PCR最適退火溫度為53 ℃，第二輪PCR最適退火溫度為53 ℃；鎂離子濃度為2.5 mmol·L-1。對鹿人五毛滴蟲的檢測精度可達(dá)每毫升10個蟲體DNA；對犬賈第蟲、陰道毛滴蟲、弓形蟲、柔嫩艾美爾球蟲、大腸桿菌、旋毛蟲基因組DNA的擴(kuò)增的結(jié)果均為陰性；68份鹿糞便樣品鹿人五毛滴蟲的檢出率為50%。由此可見，建立的巢式PCR檢測方法具有較高的靈敏度和特異性，可用于鹿人五毛滴蟲感染的臨床檢測。

關(guān)鍵詞：鹿；腸道毛滴蟲；巢式PCR

中圖分類號：S852.72 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.05.002

毛滴蟲是一種有鞭毛的單細(xì)胞真核生物，其滋養(yǎng)體經(jīng)而分裂增殖，主要寄生在泌尿生殖系統(tǒng)以及胃腸道，宿主范圍廣泛[1]。目前，常見的毛滴蟲有人五毛滴蟲（Pentatrichomonas hominis）、陰道毛滴蟲（Trichomonas vaginalis）、口腔毛滴蟲（Trichomonas tenax）、胚胎三毛滴蟲（Trichomonas foetus）、鳥毛滴蟲（Trichomonas gallinae）、豬三毛滴蟲（Tritrichomonas suis）、巴特里四毛滴蟲（Tetratrichomonas buttreyi）等，其中人五毛滴蟲被認(rèn)為是寄生在哺乳動物腸道內(nèi)的一類共生類寄生蟲[2]，近幾年，在我國河南、湖北、廣東、安徽等地均有關(guān)于人感染人五毛滴蟲的臨床病例報道[3-8]，而在犬、貓、非靈長類和嚙齒類動物的糞便樣品中，也檢測到了人五毛滴蟲的感染 [9-11]。由于尚未有關(guān)于鹿感染人五毛滴蟲的報道，因而構(gòu)建一個快速有效的檢測方法來評估鹿感染人五毛滴蟲的感染情況顯得十分必要。

人五毛滴蟲主要通過污染飲用水或者食物而被動物或者人誤食而感染，在傳播過程中蒼蠅等也發(fā)揮著一定作用，其感染后主要癥狀表現(xiàn)為腹瀉[12]。診斷腸道毛滴蟲的主要方法包括直接涂片鏡檢法、蟲體培養(yǎng)法、染色鏡檢法、普通PCR 檢測法、巢氏PCR檢測法、原位雜交檢測法等[13]，其中直接涂片鏡檢法、蟲體培養(yǎng)法、普通PCR 檢測法和染色鏡檢法精確度不高，原位雜交檢測法實驗條件要求高且步驟復(fù)雜，而巢式PCR檢測法常被視為一種快速、便捷、有效的檢測方法。本試驗通過18S rRNA基因設(shè)計了特異性的巢式PCR引物，對鎂離子濃度及退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)一步進(jìn)行了特異性和靈敏性驗證，成功構(gòu)建了鹿人五毛滴蟲巢式PCR檢測方法。采用構(gòu)建的巢式PCR檢測方法對長春地區(qū)68份鹿糞便樣品進(jìn)行了檢測，以期為臨床檢測鹿人五毛滴蟲的感染提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 基因組DNA

試驗中涉及的人五毛滴蟲、柔嫩艾美爾球蟲、伊氏錐蟲、弓形蟲、陰道毛滴蟲、賈第蟲均來自于吉林大學(xué)寄生蟲實驗室保存或者培養(yǎng)的，分別提取對應(yīng)的基因組DNA并保存在-20 ℃冰箱中。試驗中用于臨床檢測的68份鹿糞便樣品，均來自于吉林省長春市某養(yǎng)殖場，分別提取對應(yīng)的基因組DNA并保存在-20 ℃冰箱中備用。

1.2 主要試劑

rTaq DNA聚合酶、dNTP，MgCl2等用于PCR反應(yīng)的試劑均購自TaKaRa公司（日本）；DL2000 DNA marker購自TaKaRa公司（日本）；瓊脂糖購自法國Biowest公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

從Genbank中查找到人五毛滴蟲18S rRNA基因序列（AY758392），根據(jù)此特異性序列，采用Primer Premier 5軟件設(shè)計內(nèi)外兩套特意性的巢式PCR引物，外側(cè)引物： F1為5′- AGACACGGAGGCGAAGG-3′，R1為5′- AGCCCAGAGCATCTAA AGGA-3′；內(nèi)側(cè)引物：F2為5′- AGTTCTTGGGCTC TGGG-3′，R2為5′- CCTCTTCCGCCTGCTA -3′。經(jīng)兩輪PCR反應(yīng)后，擴(kuò)增的目的片段為大小為322bp的特異性序列。PCR反應(yīng)中使用的引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.4 反應(yīng)體系中Mg2+濃度的優(yōu)化

以人五毛滴蟲基因組DNA作為模板，F(xiàn)1/ R1引物對作為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)， MgCl2 0.5～5.5 mmol·L-1，5 μL dNTPs，0.5 μL rTaq酶，引物F1和 R1各1 μL，以雙蒸水補(bǔ)足體積至50 μL。退火溫度為53 ℃，延伸時間為35 s。在PCR反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對比目的條帶的亮度。

1.5 退火溫度的優(yōu)化

分別對巢式PCR的兩輪PCR反應(yīng)的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，第1輪PCR反應(yīng)（引物對為F1/ R1）以人五毛滴蟲基因組DNA作為模板，MgCl2的終濃度為2.5 mmol·L-1，其他試劑加入量參照上述PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性3 min，退火（50，53，55，58 ℃）1 min，72 ℃延伸35 s，循環(huán)30次； 72 ℃延伸10 min。

第2輪PCR反應(yīng)，取1 μL第一輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物作為模板，以內(nèi)側(cè)引物對F2/R2作為此次PCR反應(yīng)的引物，反應(yīng)體系參照第一輪PCR反應(yīng)，退火溫度設(shè)置4個梯度，分別是50，53，55，58 ℃。在PCR反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并送吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行測序分析。

1.6 方法的驗證

1.6.1 靈敏度測試 取人五毛滴蟲，計數(shù)，分別將其稀釋成1，1 × 101，1 × 102，1 × 103，1 × 104，1 × 105個·mL-1，提取對應(yīng)的基因組DNA，采用構(gòu)建好的巢式PCR檢測方法進(jìn)行檢測，測試其靈敏度。

1.6.2 特異性驗證 以人五毛滴蟲基因組DNA作為陽性對照，雙蒸水作為陰性對照，采用已經(jīng)構(gòu)建好的巢式PCR反應(yīng)對柔嫩艾美爾球蟲、伊氏錐蟲、弓形蟲、陰道毛滴蟲、賈第蟲、犬心絲蟲的蟲體基因組進(jìn)行檢測，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 樣品的檢測

以人五毛滴蟲基因組DNA作為陽性對照，雙蒸水作為陰性對照，采用已構(gòu)建好的巢式PCR方法對采集到的68份鹿糞便臨床樣品進(jìn)行檢測，并送吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行測序分析，將測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行序列的比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)體系中最佳Mg2+濃度

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，由電泳圖可知，巢式PCR反應(yīng)在MgCl2濃度為0.5～5.5 mmol·L-1區(qū)間均能擴(kuò)增出較好的條帶，不同MgCl2濃度其對應(yīng)的PCR產(chǎn)物亮度有差異，當(dāng)Mg2+濃度為2.5 mmol·L-1時，擴(kuò)增出的目的片段最亮，見圖1。因此選擇2.5 mmol·L-1作為巢式PCR反應(yīng)的最佳Mg2+濃度。

bp M 1 2 3 4 5 6

2.2 最佳退火溫度

為了摸索適合于本巢式PCR反應(yīng)的退火溫度，本試驗設(shè)計了50，53，55，58 ℃這4個溫度梯度，以期探索出退火溫度對巢式PCR反應(yīng)的影響。瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，第一輪和第二輪PCR反應(yīng)50，53，55，58 ℃這4個退火溫度均能擴(kuò)增出目的片段，且第一輪PCR反應(yīng)和第二輪PCR反應(yīng)均在53 ℃退火溫度條件下擴(kuò)增出較為明亮的PCR產(chǎn)物，見圖2。將測序結(jié)果經(jīng)拼接后，BLAST比對，結(jié)果顯示其均為人五毛滴蟲18S rRNA基因的特異性片段。將PCR反應(yīng)重復(fù)操作兩次，電泳結(jié)果相一致，故可選擇53℃作為兩輪PCR反應(yīng)的退火溫度。

bp M 1 2 3 4 5 6 7 8

2.3 方法的驗證結(jié)果

2.3.1 靈敏度 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示，當(dāng)蟲體濃度為10個·mL-1及以上時，可見明亮的條帶即PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了目的條帶。將PCR反應(yīng)重復(fù)操作兩次，電泳結(jié)果相一致，表明本試驗構(gòu)建的巢式PCR檢測方法可檢測的最低蟲體量為10個·mL-1。

bp M 1 2 3 4 5 6

2.3.2 特異性 將已完成了兩輪PCR反應(yīng)的8個樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖4。由圖可知，只有模板為人五毛滴蟲基因組DNA的樣品才擴(kuò)增出目的條帶，以其他蟲體基因組DNA為模板的樣品未擴(kuò)增出目的條帶。由此表明構(gòu)建的巢式PCR檢測方法具有較強(qiáng)的特異性。

bp M 1 2 3 4 5 6 7 8

2.4 樣品檢測結(jié)果

分別對68份鹿糞便臨床樣品進(jìn)行基因組提取，然后采用此巢式PCR反應(yīng)進(jìn)行檢測，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，34份樣品的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)目的條帶，通過對擴(kuò)增出的目的片段進(jìn)行測序、比對，證明其均為人五毛滴蟲18S rRNA基因的特異性片段，鹿糞樣品人五毛滴蟲的檢出率為50%。

3 討 論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其越來越廣泛的運(yùn)用于對毛滴蟲的分類鑒定中，Gookin等[14]采用18S rRNA基因、ITS1， 5.8S rRNA， ITS2基因以及部分28S rRNA基因作為靶基因?qū)γ蜗x進(jìn)行了分子分類鑒定，通過對基因序列的比對確定了其所觀察到的毛滴蟲為人五毛滴蟲。

核糖體RNA也就是rRNA是細(xì)胞內(nèi)含量最多的一類RNA，其與蛋白質(zhì)組合而成的核糖體參與了細(xì)胞內(nèi)肽鏈的合成。對于真核生物，rRNA根據(jù)沉降系數(shù)可將其分為四類，即5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA。由于18S rRNA含量較高，長度適宜，大約在1 900 bp，且其存在核糖體蛋白質(zhì)復(fù)合物中[15]，能夠為18S rRNA提供一個隔絕RNA酶和其他外界不利因素影響的安全環(huán)境，使18S rRNA能夠保持很強(qiáng)的穩(wěn)定性[16]。因此，18S rRNA常被用來對寄生蟲進(jìn)行種屬鑒定、遺傳多樣性分析、系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化研究、分子分類乃至于抗藥性等研究 [17-18]。

目前，對于毛滴蟲最常用的檢測方法是PCR技術(shù)。但是，普通的PCR技術(shù)的靈敏度不是很高，且容易出現(xiàn)假陽性。巢氏PCR通過使用內(nèi)外兩套引物對特異性基因進(jìn)行不同大小片段的兩次擴(kuò)增，只需要極少量的模板，即可擴(kuò)增出理想的PCR產(chǎn)物極大的提高了檢測的靈敏度，并保證了檢測結(jié)果的特異性[19]。

本試驗通過選取人五毛滴蟲18S rRNA基因片段，建立了鹿人五毛滴蟲巢式PCR檢測方法，在對巢式PCR反應(yīng)中涉及到的退火溫度、Mg2+濃度進(jìn)行了優(yōu)化后，此檢測方法表現(xiàn)出了較高的靈敏度和特異性。通過對臨床樣品的檢測結(jié)果的分析，證明了檢測的巢式PCR檢測方法可以用來對鹿人五毛滴蟲的臨床檢測。同時，通過對鹿的糞便樣品的檢測，說明了人五毛滴蟲可以感染鹿且具有較高的感染率，人五毛滴蟲可能會由鹿傳播給人，存在著人獸共患的風(fēng)險。

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