王成龍　源朝政　陳海霞　蔣輝

摘 要：以龍山卷丹百合的病葉為試材，采用DAS-ELISAS檢測(cè)法對(duì)樣品進(jìn)行百合黃瓜花葉病毒的檢測(cè)，檢出率為75%；提取總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增其外殼蛋白基因大小為514 bp，和預(yù)期條帶大小一致。經(jīng)Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因片段與Genbank上發(fā)表的CMV CP基因序列同源性達(dá)96.7%。

關(guān)鍵詞：卷丹百合；RT-PCR；DAS-ELISA；百合黃瓜花葉病毒

中圖分類號(hào)：S642.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.05.004

百合聚觀賞、食用和藥用于一體，有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。卷丹百合在湖南栽培歷史悠久，是湖南龍山重要的農(nóng)產(chǎn)品之一。

百合病毒病是繼真菌性病害之后的又一重要病害，發(fā)病率高達(dá)40%以上，在一定程度上限制了我國(guó)百合的生產(chǎn)，并造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，已報(bào)道的百合病毒病有10多種，其中對(duì)百合生產(chǎn)危害較大的有3種：百合無(wú)癥病毒（Lily symptomless virus，LSV）發(fā)生最為普遍，百合斑駁病毒（Lily mottle virus，LMoV）主要侵染葉片和花部，表現(xiàn)為斑駁，黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV） 一般為潛隱侵染，常與百合無(wú)癥病毒復(fù)合侵染 [3-6]。黃瓜花葉病毒侵染后主要表現(xiàn)為葉片扭曲，葉面和葉脈有黃斑，花有褐色斑點(diǎn)，且植株矮化，如與百合無(wú)癥病毒復(fù)合侵染，則產(chǎn)生褪綠壞死斑癥狀，目前在多地東方百合栽培品種中已檢測(cè)出CMV，并得到病毒分離物[7-11]，但關(guān)于湖南龍山卷丹百合感染CMV的報(bào)道尚少。為了建立適用于生產(chǎn)實(shí)際的百合CMV檢測(cè)技術(shù)，本研究首先采集龍山卷丹百合基地的病樣，再結(jié)合酶聯(lián)免疫法和RT-PCR法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行鑒定，旨在探索建立湖南龍山卷丹百合病毒檢測(cè)的技術(shù)體系。

1 材料和方法

1.1 DAS ELISA檢測(cè)法

1.1.1 材料及主要試劑 檢測(cè)樣品：卷丹百合病株樣品采自湖南省湘西州龍山縣百合產(chǎn)區(qū)，田間感病株呈現(xiàn)植株矮縮束頂、部分葉片皺縮、斑駁、條斑和葉脈黃化等生長(zhǎng)受阻的癥狀。

陽(yáng)性對(duì)照：即含CMV病毒的樣品，購(gòu)自上海卡奴生物科技有限公司。

陰性對(duì)照：不含CMV病毒的樣品，購(gòu)自上?？ㄅ锟萍加邢薰?。

將0.5 g新鮮百合病葉置于預(yù)先加入液氮研缽中充分研磨，再轉(zhuǎn)移到裝有200 μL裂解液的1.5 mL離心管中，勻漿；4 ℃，15 000 g，離心5 min，棄沉淀，20 ℃保存上清。病毒檢測(cè)方法參照CMV DAS-ELISA試劑盒（購(gòu)自上海卡奴生物科技有限公司）操作步驟進(jìn)行。

1.1.2 判斷標(biāo)準(zhǔn) 病毒感染結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：臨界值（CO）=陰性對(duì)照均值+0.15；百合黃瓜花葉病毒（CMV）陰性=樣品OD值< 臨界值；百合黃瓜花葉病毒（CMV）陽(yáng)性=樣品OD值> 臨界值。

1.2 RT PCR檢測(cè)法

1.2.1 材料及主要試劑 從田間采集有癥狀的病葉進(jìn)行DAS-ELISA方法檢測(cè)，然后依據(jù)檢測(cè)結(jié)果，將呈陽(yáng)性的卷丹百合病葉用于百合黃瓜花葉病毒的RT-PCR檢測(cè)。

主要試劑：植物類病毒RNA核酸提取試劑盒（武漢哇哇噻納技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；cDNA第一鏈合成試劑盒（北京天根生物科技有限公司）；DNA凝膠純化回收試劑盒（Vigene Biotech公司）；RT-PCR反應(yīng)所采用的試劑High dNTPs-Taq DNA多聚酶、10×PCR Buffer均購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI（美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心）已登記的CMV病毒的CP基因序列，利用計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物：5'-CTGCGGATGCCACCTTCA-3'，下游引物：3'-GTGGGAATGCGTTGGTGC-5'，由上海生工生物工程有限公司合成引物，擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期大小為514 bp。

1.2.3 總RNA的提取和RT-PCR 研缽滅菌待用，稱取0.5 g新鮮的百合病葉放入研缽，加入液氮迅速研成粉末，其他步驟按照RNA核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的RNA通過(guò)1%瓊脂凝膠和溴化乙錠（EB）染色后，進(jìn)行電泳檢測(cè)質(zhì)量[12]，最后保存在-80 ℃冰箱待用。將提取的卷丹百合病葉的RNA合成cDNA。具體操作步驟按照天根公司cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為50 μL，其中包括模板cDNA 4 μL， Taq酶0.6 μL，上游和下游引物各1 μL，其他組分和操作步驟參照vitrogen反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸6 min，4 ℃保存。再取4 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，用含EB的1%瓊脂糖凝膠電泳25 min，使用Gene Snap凝膠成像儀拍照。再送樣至南京金斯瑞生物科技有限公司對(duì)純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，最后將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DAS ELISA檢測(cè)結(jié)果

從圖1的顯色反應(yīng)結(jié)果可知，在12個(gè)待檢樣品中顯色為陽(yáng)性的有9個(gè)，不顯色呈陰性的有3個(gè)，酶標(biāo)儀讀取的數(shù)據(jù)結(jié)果表明（表1），其中顯色的9個(gè)樣品OD值大于臨界值，不顯色的3個(gè)樣品OD值小于臨界值，這與顯色反應(yīng)的結(jié)果完全一致，檢出率達(dá)75%，從而初步推斷黃瓜花葉病毒侵染了龍山卷丹百合。

2.2 RNA提取

由圖2可見(jiàn)，提取的總RNA條帶清晰，且均無(wú)明顯的拖尾現(xiàn)象，通過(guò)核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)得知，OD260/OD280的比值在1.8～2.0之間，因此說(shuō)明RNA完整性和純度質(zhì)量高。

2.3 RT-PCR測(cè)序結(jié)果及序列分析

以cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。由圖3可知，泳道4、5和6為病葉樣品，呈陽(yáng)性，確定攜帶黃瓜花葉病毒，該病葉樣品RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶約為500 bp，與預(yù)期片段大小相符，并與陽(yáng)性對(duì)照片段大小一致，這說(shuō)明RT-PCR具有一定的特異性，能檢測(cè)出卷丹百合病葉中的黃瓜花葉病毒。測(cè)序結(jié)果表明，黃瓜花葉病毒擴(kuò)增產(chǎn)物共含有514個(gè)核苷酸，將獲得的CMV擴(kuò)增序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST，結(jié)果表明與已登錄的荷蘭地區(qū)分離物AJ131618、AJ131619和AJ131615的同源性達(dá)96.7%，說(shuō)明該序列確為CMV序列。從而進(jìn)一步表明DAS-ELISA檢測(cè)呈陽(yáng)性的百合樣品感染了百合黃瓜花葉病毒。

3 結(jié)論與討論

目前，百合病毒病的研究逐漸系統(tǒng)化和清晰化，但主要集中在切花百合的研究上，CMV作為侵染百合的主要病毒之一，雖在世界上已有不少報(bào)道，但這是首次在龍山卷丹百合中報(bào)道。卷丹百合是龍山特色農(nóng)業(yè)的重要組成部分，栽培歷史長(zhǎng)達(dá)50多年，近年來(lái)栽培面積卻逐年縮減，究其原因主要是多年的無(wú)性繁殖，百合病毒病侵染嚴(yán)重，導(dǎo)致引種種球質(zhì)量和產(chǎn)量的降低，打擊了農(nóng)戶的積極性。黃瓜花葉病毒的侵染主要是引起百合花葉病，表現(xiàn)為花葉、葉扭曲、葉面凹凸不平的泡斑；重病植株矮化、鱗片短甚至不能開(kāi)花[13]。通過(guò)產(chǎn)區(qū)的實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，植株矮化和葉片簇生現(xiàn)象非常明顯，因此開(kāi)展龍山卷丹百合病毒病調(diào)查意義重大。本研究將采回的病株分別采用DAS-ELISA和RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，對(duì)卷丹百合感染CMV的情況進(jìn)行檢測(cè)，確定湖南龍山產(chǎn)區(qū)的卷丹百合已被百合黃瓜花葉病毒感染。

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