孫明潔, 王 開, 朱俊輝, 張雪竹, 曹東梅, 楊金鑫, 胡桂學(xué)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 吉林 長春130118)

犬細(xì)小病毒(CPV)屬細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬成員。 CPV 為無囊膜的線性單股負(fù)鏈DNA 病毒,其基因組全長約為5 300 nt,由4 個開放閱讀框(ORF)組成,為編碼結(jié)構(gòu)蛋白的VP1 和VP2,非結(jié)構(gòu)蛋白NS1 和NS2 組成。 衣殼蛋白VP1 和VP2 蛋白構(gòu)成互相疊加,其中VP2 蛋白占總衣殼的90%。 VP2 蛋白是構(gòu)成病毒抗原決定簇的主要組成部分,該蛋白可使機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[1]。 將近40 年的流行過程,CPV 發(fā)生了多次抗原變異,出現(xiàn)了CPV-2a、CPV-2b 及CPV-2c 亞型,而且病毒能在貓體內(nèi)增殖并引起發(fā)病。 受感染的犬更容易在環(huán)境中傳播和儲存病毒,成為貓科動物的感染源[2]。 目前常用的疫苗還是傳統(tǒng)的滅活疫苗及弱毒疫苗,且疫苗的免疫效果有限,同時還易出現(xiàn)過敏、散毒、毒力返祖和病毒污染環(huán)境造成交叉感染等現(xiàn)象。 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,基因工程疫苗和病毒樣顆粒疫苗等新型疫苗陸續(xù)出現(xiàn)并已成為未來疫苗的發(fā)展方向。 本文通過對近些年國內(nèi)外CPV 新型疫苗的研究現(xiàn)狀進(jìn)行介紹,為以后的疫苗研發(fā)提供參考。

1 基因疫苗

基因疫苗即核酸疫苗,是利用基因工程技術(shù)將單種或多種抗原基因克隆到真核表達(dá)載體,并將構(gòu)建的重組質(zhì)粒直接注入動物體內(nèi),激活機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答[3]。 該疫苗進(jìn)入機(jī)體后,可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔與MHCⅠ或Ⅱ類分子結(jié)合形成抗原肽-MHC -分子復(fù)合物,分別被細(xì)胞表面CD8+或CD4+細(xì)胞識別,隨后誘發(fā)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答[4]。 基因疫苗被推崇不僅因為其可同時誘發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫,而是其易于設(shè)計構(gòu)建且可表達(dá)具備天然構(gòu)象的抗原,相對安全,便于大規(guī)模生產(chǎn)的特點被逐漸認(rèn)可。

犬細(xì)小病毒VP2 蛋白是重要的保護(hù)性抗原蛋白,與病毒的組織噬性及宿主范圍皆有著密切聯(lián)系,因此很多學(xué)者都用其作為制備基因疫苗的重要候選蛋白[5]。 但同時因為VP1 基因(2 256 bp)包含著整個VP2 基因(1 755 bp)完整的閱讀框,且3′端序列完全一致,二者序列幾乎相同,因此VP1 也常被用來作為CPV 的抗原基因。 謝之景等利用VP2蛋白構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pVCPV,由對小鼠的3 次免疫試驗可證實該CPV 核酸疫苗可成功誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)[6-7]。 邱薇等利用VP1 基因構(gòu)建了真核表達(dá)載體pIRESVP1,運用不同計量的重組質(zhì)粒對6 只犬進(jìn)行免疫接種,發(fā)現(xiàn)所有免疫犬均未發(fā)病,表明構(gòu)建的核酸疫苗可使試驗犬抵抗CPV 強毒的攻擊[8]。吳植等利用CPV VP2228蛋白與細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞抗原-4 胞外區(qū)(CTLA-4125) 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-CTLA-4125-VP2228免疫BALB/c 雌性小鼠,檢測結(jié)果表明,pVAX1-CTLA-4125-VP2228能產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答且CTLA-4125-VP2228融合DNA 能有效的提高小鼠對抗原的免疫應(yīng)答效果。 該研究不僅證實了基因疫苗的可靠性同時為CPV 特異性靶向基因疫苗研究奠定了基礎(chǔ)[9]。 而Shyam 研究了一種基于復(fù)制子載體(pAlpha)的新型核酸疫苗CPV-VP2,當(dāng)接種試驗動物后發(fā)現(xiàn)這種新型核酸疫苗可在犬中產(chǎn)生明顯高于普通核酸疫苗和商品化CPV 疫苗的抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)[10]。 核酸疫苗技術(shù)自從被開發(fā),就被廣大學(xué)者不斷的探索與應(yīng)用,但也存在著一些問題,如遺傳毒性、是否會整合到宿主染色體中誘發(fā)突變、引起自身免疫病等[11]。 隨著研究的深入,一種以甲病毒復(fù)制子載體的自殺性DNA 疫苗,成為核酸疫苗發(fā)展的新方向,這種自殺性DNA 疫苗不僅可產(chǎn)生高水平的免疫應(yīng)答,而且可以誘導(dǎo)dsDNA 介導(dǎo)抗病毒途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而可消除外源的DNA 疫苗長期在機(jī)體內(nèi)存在引發(fā)的不必要反應(yīng),該技術(shù)將是核酸疫苗發(fā)展的新方向[12]。

2 基因工程活載體疫苗

基因工程重組活載體疫苗是一種將1 個或多個病原的保護(hù)性抗原基因與非致病性的微生物(病毒和細(xì)菌)進(jìn)行重組,誘導(dǎo)產(chǎn)生具有特異性免疫原性的活疫苗[13]。 該疫苗不僅可以誘發(fā)細(xì)胞和體液免疫,甚至可以產(chǎn)生黏膜免疫。 活載體疫苗因其免疫效果好、成本低、便于大規(guī)模制備等優(yōu)點,已成為業(yè)界重點關(guān)注的疫苗之一。 主要的重組活載體疫苗有細(xì)菌活載體疫苗和病毒活載體疫苗。

2.1 病毒活載體疫苗 病毒活載體疫苗是以低毒性的病毒為重組載體,利用病毒的啟動子在非結(jié)構(gòu)基因區(qū)域復(fù)制表達(dá)。 該疫苗具備了所有常規(guī)疫苗的優(yōu)點,同時也利于多價疫苗的構(gòu)建。 常用的病毒載體有腺病毒、痘病毒、皰疹病毒等。 有研究者利用狂犬病毒作為載體,成功構(gòu)建了重組病毒rBNSPCPV-VP2,隨后將重組病毒與GEL 佐劑融合免疫小鼠,不僅證實構(gòu)建重組的RABV 和CPV 二聯(lián)苗可以抵御RABV 致死性感染同時也可產(chǎn)生較高水平的CPV 抗體[14]。 楊洋等將VP2 蛋白與人5 型腺病毒進(jìn)行重組,構(gòu)建了rAd5v-cVP2 真核細(xì)胞表達(dá)載體,并證明可產(chǎn)生針對VP2 的特異性抗體[15]。 也有學(xué)者以高傳代狂犬病病毒Flury (HEP-Flury)株和攜帶雙G 蛋白的重組狂犬病病毒為載體,分別構(gòu)建了用來表達(dá)VP2 蛋白的重組活疫苗rHEP-VP2 和rHEP-dG-VP2,他們可以同時產(chǎn)生較高水平的抗CPV 和RABV 的抗體。 這種針對同一動物的嵌合病毒活載體疫苗,為重組活載體疫苗的發(fā)展提供了新思路[16]。

2.2 細(xì)菌活載體疫苗 細(xì)菌活載體疫苗是以細(xì)菌基因組或表達(dá)質(zhì)粒為載體,將某種病原體的抗原基因插入,構(gòu)成可表達(dá)特異保護(hù)抗原的活載體疫苗。常用的細(xì)菌載體有減毒沙門菌、李氏桿菌、乳酸菌、卡介苗和大腸桿菌等。 張云霞曾用畢赤酵母分泌表達(dá)載體與VP2 基因連接,成功構(gòu)建pPICZαA -VP2 真核表達(dá)載體,其表達(dá)的VP2 蛋白具有反應(yīng)原性并能被CPV 的陽性血清識別[17]。 許云華利用乳酸球菌與克隆連接的pXYSEC：Nuc -VP2 基因重組融合,獲得了重組乳酸球菌pXYSEC：CVP2/NCDO2118 菌株,誘導(dǎo)表達(dá)后的VP2 蛋白可與鼠抗CPV 高免血清發(fā)生特異性結(jié)合[18]。 韓冬梅等利用大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)B 亞基基因作為生物佐劑與VP2 基因和含有人的CD5 信號肽的載體pcDNACD5sp 共同連接,構(gòu)建了pcDNA - CD5sp - LTB -VP2-70 融合表達(dá)載體,證明LTB 可使CPV 重組疫苗明顯提高體液免疫水平[19]。 基因工程技術(shù)構(gòu)建的活載體疫苗,已經(jīng)全面的展現(xiàn)了其作為新型疫苗的優(yōu)勢,不僅可以構(gòu)建聯(lián)苗,而且可以利用具有優(yōu)勢的載體在表達(dá)相關(guān)抗原上操作,其操作簡單且可高效的表達(dá)抗原蛋白,而且有些載體還可作為生物佐劑加強免疫效果,這些都是傳統(tǒng)疫苗所無法比擬的。

3 亞單位疫苗

亞單位疫苗是基因工程技術(shù)研發(fā)的又一種新型疫苗,又稱重組亞單位疫苗,指利用病原體的一個或多個保護(hù)抗原基因與真核或原核表達(dá)載體進(jìn)行重組表達(dá),對表達(dá)的免疫蛋白組裝并添加生物佐劑制成的疫苗。 亞單位疫苗因其不含有病原核酸而發(fā)生散毒,且不會因病毒其他抗原無關(guān)成分干擾造成一系列的過敏反應(yīng)而倍受關(guān)注。 毛倩倩等學(xué)者將pET28a-CPV -VP2 表達(dá)質(zhì)粒制備的VP2 蛋白添加佐劑乳化構(gòu)成免疫原,經(jīng)IPMA 檢測抗體滴度達(dá)到1 600 倍且中和效價為1∶2 884 明顯高于同類研究,該研究為后期亞單位疫苗的研究奠定基礎(chǔ)[20]。 有學(xué)者將犬瘟熱病毒T′TB 基因和犬細(xì)小病毒VP2 基因同時連入到桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTc,通過轉(zhuǎn)化獲得同時含有CDV T′TB 和CPV VP2 重組質(zhì)粒,最后轉(zhuǎn)染到Sf-9 昆蟲細(xì)胞,獲得T’TB 和VP2 重組融合蛋白,能誘導(dǎo)小鼠同時產(chǎn)生兩種特異的中和抗體,該研究為二聯(lián)亞單位疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)[21]。 雖然亞單位疫苗在安全性能上表現(xiàn)明顯的優(yōu)勢,但是其技術(shù)相對不成熟且需要多次免疫才能獲得傳統(tǒng)疫苗的免疫抗體水平,因此目前尚處在試驗階段。

4 病毒樣顆粒疫苗

病毒樣顆粒(Virus-Like Particles, VLPs)疫苗是一種將病毒結(jié)構(gòu)基因插入到特定的表達(dá)載體中,并通過真核或原核細(xì)胞表達(dá)相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白,最后裝配成具有病毒樣無核酸的高度結(jié)構(gòu)化空心顆粒。VLPs 疫苗不僅具有較高的生物安全性,而且因其可以模擬病毒完整的天然構(gòu)象與病毒相似,因此VLPs疫苗可通過病毒感染侵襲途徑,被抗原遞呈細(xì)胞(Antigen-presenting cell,APC)識別吞噬,誘發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)。 VLPs 也可直接刺激DCs,促進(jìn)DCs 產(chǎn)生促炎因子,誘發(fā)保護(hù)性細(xì)胞免疫發(fā)生[22]。 VLPs 疫苗能誘導(dǎo)強有力的免疫應(yīng)答,與其能組裝完整的病毒結(jié)構(gòu)密切相關(guān),相比亞單位疫苗單一的抗原表位,其更具完整性、天然性,不僅保留了更完整的抗原表位,且這些抗原結(jié)構(gòu)被VLPs 疫苗富集在一起,所以其能誘導(dǎo)比可溶性蛋白更強、更持久的免疫反應(yīng)。 有研究報道,CPV 病毒樣顆粒疫苗可在在桿狀病毒表達(dá)載體上產(chǎn)生高HA 滴度,且構(gòu)建的CPV VLPs 疫苗經(jīng)肌肉和口服實驗犬可以產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答反應(yīng),并證明由于CPV VLPs 可以在體內(nèi)或體外都具有較好的抗原性,可用來構(gòu)建多種疾病的嵌合疫苗[23]。 有學(xué)者也曾報道,利用CPV VP2 基因與pSMK 載體連接,將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pSMKVP2 導(dǎo)入BL21 內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá),并將獲得VP2 蛋白分離純化去除標(biāo)簽,隨后通過透射電子顯微鏡觀察,顯示VP2 蛋白自我組裝成VLPs 并與CPV 天然構(gòu)象十分相似,利用該CPV VLPs 免疫小鼠,可以刺激小鼠產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答[24]。 有研究利用桿狀病毒表達(dá)載體構(gòu)建了CPV Bac-VP2 表達(dá)載體,發(fā)現(xiàn)其感染昆蟲或家蠶后,可產(chǎn)生豐富的CPV VP2 蛋白,通過電鏡觀察證實,昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的CPV VP2 蛋白可自我組裝形成25 nm 球形的VLPs,且與天然CPV 有較高的相似性[25]。

VLPs 不僅可以成為疫苗還可以成為載體,通過融合表達(dá)或化學(xué)偶聯(lián)的方式將外源的抗原多肽與VLPs 結(jié)合構(gòu)建嵌合的VLPs。 以抗原多肽與VLPs 的可加強免疫的優(yōu)勢,開發(fā)兼具預(yù)防和治療雙重作用的嵌合VLPs 疫苗。 此外,基于VLPs 研制的攜帶外源DNA 和腫瘤特異性抗原制備的治療性疫苗藥物也成為當(dāng)前研究的熱點[26-27]。 以上針對CPV VLPs 疫苗的研究表明,VLPs 疫苗具有推廣研究的實用價值,其不僅可以作為安全高效的疫苗和良好的治療型疫苗VLPs 載體,而且也可用于病毒的基礎(chǔ)研究,如病毒的結(jié)構(gòu)形態(tài)、病毒的侵襲機(jī)制和病毒受體融合的過程等。 VLPs 疫苗良好的發(fā)展前景,將成為CPV 新一代疫苗的研究方向,使其能批量高效生產(chǎn)。

5 展望

犬細(xì)小病毒在自然界分布極其廣泛,嚴(yán)重影響著寵物犬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。 雖然市場上以商品化的滅活疫苗和弱毒苗進(jìn)行免疫,但是因其常存在散毒和過敏的危險,且不能有效預(yù)防CPV-2a、-2b、-2c 等多分型的感染,新型疫苗的研發(fā)已成為必然趨勢。 隨著基因工程技術(shù)的逐漸成熟,為CPV 新型疫苗的研發(fā)提供了強有力的技術(shù)支持。 然而,新型疫苗仍需解決當(dāng)前存在的免疫原性差、不能大規(guī)模生產(chǎn)等技術(shù)瓶頸問題,希望隨著研究的深入,新型CPV 疫苗能早日投入到臨床應(yīng)用。