鄒偉斌, 林梓棟, 齊冬梅

(廣東永順生物制藥股份有限公司, 廣東 廣州511356)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種具有高度傳染性的豬病毒性疾病,其主要臨床癥狀表現(xiàn)為母豬繁殖障礙和仔豬呼吸困難與高死亡率,對世界豬養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。 免疫PRRS 滅活疫苗或減毒活疫苗是目前防控豬繁殖與呼吸綜合征的主要手段,但由于PRRSV 具有抗原變異快、持續(xù)性感染和免疫抑制等特點,臨床上常常會出現(xiàn)免疫失敗或疫情加重的情況。 目前我們對PRRSV 的病毒學(xué)、起源和進(jìn)化的了解以及宿主對PRRSV 免疫應(yīng)答的認(rèn)知還十分不足,這極大地阻礙了對根除PRRSV 有效方法的開發(fā)。 本文主要通過對PRRSV 控制策略和技術(shù)研究的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述,為未來PRRSV 的控制和預(yù)防以及PRRS 新型疫苗的研發(fā)提供參考。

1 PRRSV 的簡介

1987 年,美國北卡羅來納州的農(nóng)場暴發(fā)了一種神秘豬病,主要表現(xiàn)為母豬繁殖障礙、斷奶豬肺炎和生長發(fā)育豬的死亡率增加[1]。 1991 年,該神秘豬病的病原在歐洲被分離發(fā)現(xiàn),是一種以前未被鑒定的RNA 病毒,并被命名為萊利斯塔德病毒(Lelystad virus)[2]。 隨后北美地區(qū)也很快分離到了病原,并最初稱之為豬不育和呼吸綜合征病毒(Swine infertility and respiratory syndrome virus,SIRSV)。 1992 年,這種病原被引進(jìn)了新的命名“豬繁殖與呼吸綜合征病毒”[1],后來被廣泛接受并被沿用至今。 從兩個不同大陸分離的PRRSV 被分為兩個基因型：1 型(或稱為歐洲型,代表株為Lelystad 株)和2 型(或稱為北美型,代表株為VR -2332 株)[3],兩個基因型之間的基因相似率約為60%。 PRRSV 具有高度限制的細(xì)胞嗜性,只感染單核-巨噬細(xì)胞,如豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophages,PAM),PAM 是PRRSV 在體內(nèi)的主要靶細(xì)胞[4]。

PRRSV 屬于動脈炎病毒科(Arterividae)、動脈炎病毒屬(Arterivirus),其基因組為大小約15 kb 的單股正鏈RNA,其5′端是復(fù)制酶基因,3′端的是編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因[5]。 目前已知至少包含10 個開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF),其中ORF1a和ORF1b 的占全基因組的長度超過三分之二,編碼兩個大的多聚蛋白,最后切割成14 個非結(jié)構(gòu)蛋白。而目前已知的8 個結(jié)構(gòu)蛋白分別由ORF2a,ORF2b,ORF3-7 和ORF5a 編碼[1]。

自從PRRSV 被鑒定以來,新的PRRSV 毒株不斷進(jìn)化并在全世界引起新的疫情暴發(fā),使得PRRSV控制的難題一直以來有些令人吃驚。 除了高死亡率和發(fā)病率外,PRRSV 感染還能造成宿主易繼發(fā)感染其他病毒和細(xì)菌。 目前除了疫苗外,對于感染動物尚且沒有PRRSV 特異性的治療和預(yù)防方法。然而,許多控制PRRSV 的新策略正在被研究與開發(fā)。

2 針對PRRSV 的抗病毒策略

2.1 一些miRNA 能夠抑制PRRSV 的復(fù)制 MicroRNA(miRNA)是一類廣泛存在于動物和植物中的內(nèi)源性非編碼的長度約為20 ～25 nt 的單鏈小分子RNA[6]。 研究證明,miRNA 在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮著作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的重要作用[7]。 miRNA 可以通過靶向PRRSV 基因組或宿主與PRRSV 復(fù)制有關(guān)的因子以及PRRSV 復(fù)制有關(guān)的信號通路來調(diào)控病毒的復(fù)制。 miRNA -181 與ORF4 下游的保守區(qū)域結(jié)合而抑制PRRSV 的復(fù)制[8]。 miRNA let-7f-5p通過作用 PRRSV 的受體非肌球蛋白重鏈9(MYH9)來抑制PRRSV 的復(fù)制[9],miRNA - 506通過靶向細(xì)胞分化抗原151(Cluster of differentiation 151,CD151)來阻礙PRRSV 的復(fù)制[10]。 miR -125b則通過上調(diào)NF-κB 信號通路降低PRRSV 的復(fù)制[11]。 這些能夠抑制PRRSV 病毒復(fù)制的miRNA將可能成為未來防控PRRS 的工具。

2.2 RNA 干擾技術(shù) RNA 干擾(RNA interference,RNAi)能夠誘導(dǎo)特異性的基因沉默,在動物傳染病的防治上應(yīng)用已較為廣泛。 RNAi 相關(guān)的分子包括小干擾RNA(siRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)和嗎啉低聚物(PMO)等,研究報道針對PRRSV 基因的特異性RNAi 分子能夠有效抑制PRRSV 的感染。 研究發(fā)現(xiàn),靶向NSP1α 的siRNA 能夠顯著抑制PRRSV 在MARC-145 細(xì)胞上的復(fù)制[12]。 Xie 等[13]設(shè)計的特異性靶向Nsp9 基因的siRNA 能夠有效抑制PRRSV 的復(fù)制。 特異性靶向Nsp11 的siRNA 也能夠降低PRRSV 在MARC-145 細(xì)胞上的病毒滴度[14]。Li 等[15]研究發(fā)現(xiàn),靶向PRRSV ORF1 的shRNA 能夠顯著抑制PRRSV 的復(fù)制。 鼻內(nèi)接種抗核酸酶寡核苷酸類似物pmo-5up2 能夠顯著降低PRRSV 病毒血癥和病毒引起的間質(zhì)性肺炎,表明pmo-5up2 有望成為一種新型的PRRS 控制候選產(chǎn)品[16]。 總之,基于這些小分子的RNAi 技術(shù)可能是未來控制PRRSV的有效抗病毒策略。

2.3 基因編輯技術(shù)用于控制PRRSV PRRSV 具有高度限制的細(xì)胞嗜性,研究表明,PRRSV 感染依賴各種細(xì)胞受體或因子,如硫酸肝素(Heparin sulfate,HS)、波形蛋白(Vimentin)、CD151、CD163、唾液酸粘附素CD169、CD209 和MYH9 等[5]。 但最近的研究表明,只有CD163 是PRRSV 在體內(nèi)和體外感染不可或缺的[17]。 Whitworth 等[18]研究表明,CD163基因敲除豬能夠抵抗PRRSV 的感染。 CD163 的結(jié)構(gòu)域SRCR5 是PRRSV 感染所必需的,CD163 的SRCR5 缺失豬能夠完全阻止PRRSV 的復(fù)制[17]。Whitworth 等[19]通過基因編輯技術(shù)對CD163 的SRCR5 進(jìn)行修飾得到的轉(zhuǎn)基因豬能夠有效預(yù)防PRRSV 的感染。 因此,對CD163 的基因編輯有望成為防治PRRSV 感染的新方法。

2.4 中草藥提取物和天然化合物能夠抑制PRRSV的復(fù)制 中草藥提取物被證明能夠抑制PRRSV 的復(fù)制。 Sun 等[20]通過研究發(fā)現(xiàn),丹參酮IIA 能夠通過抑制N 基因的表達(dá)和阻斷病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來抑制PRRSV 的復(fù)制。 茶葉中含量最豐富的表沒食子兒茶素沒食子酸酯也能抑制PRRSV 感染MARC-145 細(xì)胞[21]。 茶葉天然提取物中的茶籽皂甙也能抑制PRRSV 的復(fù)制,且其抗病毒機(jī)制與丹參酮IIA 相同[22]。 一些化合物能夠抑制PRRSV的感染,如綿馬鱗毛蕨中的化合物黃綿馬酸AB 能夠抑制PRRSV 在細(xì)胞與細(xì)胞之間的傳播,而且能夠顯著誘導(dǎo)PAM 中抗病毒細(xì)胞因子IFN-α、IFN-β和IL1-β 的表達(dá)[23]。 Zhang 等[24]研究表明,來自海洋真菌的蒽醌類衍生化合物TD-C 對PRRSV 的內(nèi)化和復(fù)制過程具有抑制作用。 然而,所有這些相關(guān)研究缺乏體內(nèi)的抗PRRSV 效果評價試驗。另外,這些化合物的抗PRRSV 活性是非特異性的,且其抗病毒活性的具體機(jī)制也尚不清楚。 因此,這些化合物制劑在PRRS 的防控方面還未得到實際應(yīng)用。

2.5 納米抗體 納米抗體(Nanobody,Nb)是指來源于駱駝血液中的只由一個重鏈可變區(qū)組成的單鏈抗體片段,也稱為僅含重鏈可變區(qū)的駱駝重鏈抗體(Variable domains of Camellidae heavy chain-only antibodies,VHH)或駱駝單域抗體(Camel single-domain antibodies)。 納米抗體分子量小(僅有15 kDa),易于進(jìn)行遺傳操作,特異性強(qiáng),可溶性極高且十分穩(wěn)定,現(xiàn)已廣泛用于治療性生物制品和臨床診斷工具的開發(fā)。

Liu 等[25]首次研發(fā)了抗PRRSV 的納米抗體,從VHH 的噬菌體展示庫中分離篩選得到PRRSV Nsp9蛋白的特異性納米抗體Nb6,再利用慢病毒載體系統(tǒng)建立穩(wěn)定表達(dá)Nb6 的MARC -145 細(xì)胞系,試驗結(jié)果表明,胞內(nèi)表達(dá)的納米抗體Nb6 能夠通過抑制病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有效地抑制PRRSV 的復(fù)制。 此后,Liu 等[26]又利用相同的研究方法開發(fā)的基于PRRSV Nsp4 蛋白的納米抗體也能夠有效抑制PRRSV 在MARC-145 細(xì)胞中的復(fù)制。 因此,納米抗體在開發(fā)PRRSV 控制新策略的研究方面表現(xiàn)出良好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2.6 新型PRRSV 疫苗的研發(fā) PRRSV 毒株的基因和抗原的不斷快速變異使得現(xiàn)有疫苗對PRRS很難起到有效的防控作用。 此外,近年來PRRS 活疫苗的廣泛使用也在一定程度上加速了PRRSV毒株的遺傳變異和免疫逃避能力的進(jìn)化。 許多諸如此類的難題給目前PRRS 的防控帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。 因此,利用不斷發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)開發(fā)新型的廣譜PRRSV 疫苗將是未來PRRS 防控的重要方向之一。

目前,新型PRRSV 疫苗的研究重點方向是交換來自不同PRRSV 毒株的結(jié)構(gòu)蛋白基因片段以求得到交叉保護(hù)效果優(yōu)良、具有廣譜免疫反應(yīng)且安全性高的疫苗毒株。 Zhou 等[27]通過改組不同PRRSV 毒株間的GP4 和M 得到的新型嵌合病毒可以增強(qiáng)異源性交叉中和抗體的誘導(dǎo)能力,從而能夠?qū)Χ喾N異源性PRRSV 毒株產(chǎn)生免疫保護(hù)。 最近的一項研究報道,通過改組來自6 個異源毒株的結(jié)構(gòu)蛋白基因(ORF3 -6),然后插入到作為骨架的PRRSV VR-2385 株中拯救得到的嵌合病毒表現(xiàn)出優(yōu)良的能夠抵抗多種異源毒株的交叉保護(hù)效力[28]。此外,Vu 等[29]通過對59 種PRRSV 毒株的全基因組進(jìn)行比對,然后采用計算的策略合成了1 株基因組為人工免疫原性序列的PRRSV 疫苗毒株P(guān)RRSVCON,動物實驗結(jié)果表明,該合成毒株具備了前所未有的異源性交叉免疫保護(hù)水平。 這些研究將為具有廣譜免疫保護(hù)性PRRSV 疫苗的開發(fā)奠定重要基礎(chǔ)。

3 結(jié)語及展望

自1987 年P(guān)RRS 首次暴發(fā)以來,人們致力于PRRSV 致病機(jī)制和改進(jìn)疫苗的研究,雖然付出的努力頗多,然而在PRRS 的防控方面取得的成功卻是比較有限。 免疫接種仍然是目前防控PRRSV的最常用方法,但使用現(xiàn)有疫苗的免疫接種卻收效甚微,這與PRRSV 的病原變異快和復(fù)制的免疫機(jī)制密切相關(guān)。 為了更好地控制PRRSV,研究者們正致力于開發(fā)新的防控策略。 抑制PRRSV 復(fù)制miRNA 的發(fā)現(xiàn)、RNAi 技術(shù)和基因編輯技術(shù)雖然為PRRSV 的控制提供了很好的思路,但在實際應(yīng)用中需考慮轉(zhuǎn)基因食物的安全問題。 納米抗體用于PRRSV 的防控研究還較少,開發(fā)雙特異性甚至多特異性的抗PRRSV 的納米抗體或?qū)懈玫膽?yīng)用前景。 通過人工交換或改組遺傳元素構(gòu)建交叉保護(hù)好的PRRSV 嵌合病毒用于新型的研發(fā)可以有效地解決現(xiàn)有疫苗異源性保護(hù)差的問題。隨著分子生物學(xué)發(fā)展的日新月異以及各種先進(jìn)基因工程技術(shù)的開發(fā)和廣泛應(yīng)用,期望在不久的將來開發(fā)出基于上述技術(shù)的新型PRRSV 疫苗,并使之成為防控PRRSV 的有效工具且廣泛應(yīng)用于臨床。