陳威丞等

【摘要】目的：探討血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）對人源性心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HCMECs）的影響。方法：在正常培養(yǎng)條件下，將100 nmol/L AngⅡ加入細(xì)胞中，與HCMECs共孵育12h，用蛋白印跡法檢測和細(xì)胞酶聯(lián)免疫法分別檢測神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（NRG-1）的蛋白表達(dá)和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1亞集（NRG-1β）分泌情況。結(jié)果：與空白組比較，AngⅡ處理組的NRG-1的蛋白表達(dá)和NRG-1β的分泌降低（P<005）。結(jié)論：AngⅡ能減少HCMECs的NRG-1的表達(dá)和NRG-1β分泌。

【關(guān)鍵詞】人源性心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1； 血管緊張素Ⅱ；表達(dá)影響

【中圖分類號】R5416【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2015）03-0018-03

Abstract：Objective To study the effects of angiotensin Ⅱ （AngⅡ） on expression of neuregulin-1（NRG-1） and secretion of NRG-1β in human cardiac microvascular endothelial cells（HCMECs）.Methods Under normal culture conditions， the 100 nmol / L AngⅡ added into the HCMECs， and detected expression and secretion of NRG-1 with Western blot and ELISA after 12 hours incubation.Results In AngⅡ treatment group， the expression of NRG-1 and the secretion level of NRG-1β significantly decreased compared with the control group（P< 005）. Conclusion AngⅡ could reduce the expression of NRG-1 and the secretion of NRG-1β.

Keywords：HCMECs；NRG-1； angiotensin Ⅱ；effect expression

NRG- 1是表皮生長因子家族的成員之一，是一個穿膜多肽生長因子的子集，屬于表皮生長因子家族，表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、乳腺、腸和腎臟。NRG- 1通過酪氨酸激酶受體（ ErbB2、 ErbB3 和 ErbB4） 介導(dǎo)其生物學(xué)效應(yīng)，ErbB2雖然不與NRG-1直接結(jié)合，但可與ErbB3和ErbB4結(jié)合后形成異源二聚體，NRG-1可通過反式磷酸化過程引起ErbB2形成異源二聚體發(fā)生磷酸化，從而促進(jìn)下游信號通路傳導(dǎo)，激活其下游信號通路促絲裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）途徑。微血管內(nèi)皮細(xì)胞是位于循環(huán)血液與組織液之間的單層上皮細(xì)胞，構(gòu)成血管通透性的物理屏障，保證血管內(nèi)外的物質(zhì)交換。NRG-1在血管生成和心力衰竭中起著不可缺少的作用。近期研究表明[1]，聚乳酸聚乙醇酸共聚物微粒裝載NRG-1和酸性纖維母細(xì)胞生長因子可以用來改善急性心肌梗死后的心臟功能，是通過增加血管生成，抑制心肌重構(gòu)。

1材料和方法

11儀器與試劑人源性心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞株（編號6000），胎牛血清25ml（編號8248），雙抗（編號0106），纖維連接蛋白原液（編號0103），內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑（編號0113），胰酶（編號0113）（上述試劑全購自美國Sciencell公司），DMEM低糖培養(yǎng)基（編號31600-034，購自Gibco公司），NRG-1抗體（編號MAB3771，購自美國RD公司），內(nèi)參抗體GAPDH（編號FL-335：ZS25778，購自中國中杉金橋公司），人源性NRG-1β酶聯(lián)免疫吸附測定法試劑盒（編號119-14819，購自美國RayBiotech公司），超低溫冰箱（DW-86L388型中國海爾公司），5%CO2培養(yǎng)箱（編號3110，購買于美國Thermo Electron公司）。

12HCMECs培養(yǎng)細(xì)胞復(fù)蘇前準(zhǔn)備一瓶含有纖維膜的培養(yǎng)瓶（復(fù)蘇前2h在空培養(yǎng)瓶25cm，加入4ml無血清的培養(yǎng)基，然后加入25μl纖維連接蛋白原液，放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)2h以后取出液體，造纖維膜成功）取人源性心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞株常規(guī)復(fù)蘇后，本研究室常規(guī)傳代培養(yǎng)，每瓶培養(yǎng)瓶都用25μl纖維連接蛋白原液，造出纖維膜，37°C、5%CO2培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長成單層達(dá)80%到90%的培養(yǎng)面積，用025%胰酶消化，傳代，用5、6代HCMECs用于實驗。

13蛋白免疫印跡檢測NRG-1蛋白表達(dá)收集各組細(xì)胞分別裝入到小EP管中，加入裂解液和PMSF提取細(xì)胞總蛋白，Bradford法測定蛋白的濃度，取蛋白樣品10 %聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，待電泳完畢，NRG-1用100mA的電流轉(zhuǎn)膜，內(nèi)參轉(zhuǎn)60min，NRG-1轉(zhuǎn)90min，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，在室溫下用脫脂奶粉封閉后，分別加入鼠抗人多克隆抗體NRG-1（ 1∶500）， 4°C 孵育過夜，漂洗后加二抗（ 1∶5000），37℃孵育1h ，漂洗后去暗室 X 光膠片曝光，加入 ECL 發(fā)光劑，暗房顯影，用 Quantity One 軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值，以目標(biāo)條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的基因蛋白的相對表達(dá)量。

14酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測NRG-1β蛋白的分泌收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液分別裝入到3KD的millipore蛋白離心管中，在角度轉(zhuǎn)子離心機(jī)中溫度調(diào)定為4°C，用5000離心力離心1h，剩余大概250μl左右，放入-80℃冰箱備用。使用前將所有的試劑和樣品放在室溫中05h，將準(zhǔn)備好的100μl標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分別加入到相應(yīng)的孔中，蓋好以后，在室溫中輕輕搖動孵育25h，棄去溶液，用已經(jīng)準(zhǔn)備好的300μl洗滌液洗4次，最后一次洗滌要把洗滌液完全移去，然后加入100μl制備好生物素標(biāo)記抗體到每個孔中，在室溫中輕輕搖動孵育1h，棄去溶液，用每次300μl洗滌液洗4次，棄去溶液并加入制備好的HRP溶液到每個孔中，在室溫中輕輕搖動孵育45min，棄去溶液，每次用300μl洗滌液洗4次，然后加入100μl TMB到每個孔中，避光輕輕搖動在室溫里孵育30min，加入50μl終止液到每孔，在450nm讀數(shù)。

15統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 160統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。主要試驗數(shù)據(jù)來自3 次以上重復(fù)試驗， 以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （x±s） 表示， 對主要指標(biāo)進(jìn)行正態(tài)性分布檢驗， 符合正態(tài)分布的多組間樣本比較采用單因素ANOVA 檢驗， 用LSD方法進(jìn)行兩兩比較， P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ明顯減少HCMECs的NRG-1表達(dá)和NRG-1β分泌。

在成人心臟中，NRG-1主要由內(nèi)皮細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)和釋放，而在大的冠狀動脈、靜脈及主動脈卻不表達(dá)。內(nèi)皮功能不全的一個重要的特征是一氧化氮/內(nèi)皮素水平導(dǎo)致的內(nèi)皮收縮舒張血管功能異常。在各種病理因素的作用下，內(nèi)皮細(xì)胞可以分泌多種內(nèi)源性活性物質(zhì)促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊和血栓的形成。有研究證實，冠狀動脈內(nèi)皮功能失調(diào)與脂質(zhì)斑塊形成有關(guān)[2]。有大量的實驗研究表明，心內(nèi)膜和冠狀微血管中的心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞直接影響心臟的機(jī)械性能、生長和相鄰的心肌的節(jié)律。這些影響可能是由擴(kuò)散物質(zhì)引起的（如氧化氮，前列腺素和內(nèi)皮素-1），然而近期研究表明是NRG-1介導(dǎo)這些調(diào)節(jié)的[3]。內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞之間的非旁分泌相互作用，涉及血管內(nèi)皮依賴性的電化學(xué)梯度[4]。內(nèi)皮細(xì)胞的活化和隨后的功能障礙發(fā)生相應(yīng)于生理和病理生理的刺激，并且在心血管穩(wěn)態(tài)和疾病的早期[3]。NRG1-ErbB 信號在心臟的發(fā)育及維持人類成年心臟結(jié)構(gòu)和功能的完整性中有不可或缺的作用，現(xiàn)在一些動物研究已經(jīng)證明[5]，在急性心肌損傷和慢性心力衰竭期間重組NRG1的治療效果，它能改善動物的心功能，提高動物的存活率。在高糖的狀態(tài)下和誘導(dǎo)糖尿病的大鼠模型中已證實可以降低NRG-1的表達(dá)，這項發(fā)現(xiàn)支持我們的研究結(jié)果，AngⅡ能明顯降低HCMECs的NRG-1表達(dá)和NRG-1β分泌，心力衰竭的患者由于 RAAS 的過度激活，體內(nèi)AngⅡ持續(xù)處于高水平狀態(tài)， AngⅡ可抑制HCMECs表達(dá)NRG- 1，導(dǎo)致機(jī)體 NRG-1持續(xù)處于低水平狀態(tài)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，加大心肌細(xì)胞數(shù)量的減少； 可促使機(jī)體發(fā)生病理反應(yīng)，造成心臟的損傷； 并可促進(jìn)平滑肌增生，也導(dǎo)致血管狹窄。我們的研究證實了當(dāng)AngⅡ增高的時候，AngⅡ能明顯降低HCMECs的NRG-1表達(dá)和NRG-1β分泌，影響心臟的功能。臨床上慢性心力衰竭的患者給予血管緊張素受體拮抗劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑類及β受體阻滯劑能明顯改善生存率，這或許與促進(jìn)NRG-1的表達(dá)有關(guān)。

本研究證實，AngⅡ能降低HCMECs的NRG-1表達(dá)和NRG-1β分泌，推測可在心力衰竭的病人中通過增加NRG-1來提高心臟的功能，但這需要大量的臨床試驗來進(jìn)一步證實。

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（收稿日期：20141108）