何文姬 孫幫燕 張楨

【摘要】目的：在兒科臨床上建立一種快速、準(zhǔn)確測定癲癇患兒血漿中卡馬西平（Carbamazepine，CBZ）和苯妥英鈉（Phenytoin ， PT）濃度超高液相（Ultra performance liquid chromatography ，UPLC）方法，并觀察藥物濃度與不良反應(yīng)。方法：收集癲癇患兒的超聲肝臟檢查和實驗室檢查資料。UPLC方法：取患兒血漿200μl，加入乙酸乙酯10 ml ，渦旋1 min，室溫高速離心7 min（12 000 ×g），取上清液700 μl吹干后， 100 μl甲醇復(fù)溶進樣分析；色譜條件為BEH C18色譜柱（50 mm×21 mm， 17μm； Waters公司），03 ml·min-1的流速，甲醇-1%三氟乙酸水溶液（45∶55， v/v），30℃的柱溫，2 μl的進樣量，254 nm檢測波長。結(jié)果：血漿中CBZ和PT色譜峰分離良好，無干擾，曲線為y=39589x+15280，R2=09991（CBZ）；y=37395x+30735，R2= 09996（PT），回收率均在90%～117%；超聲檢查和實驗室檢查顯示正常，無造血及消化系統(tǒng)不良反應(yīng)。結(jié)論：本法操作簡便，適用于臨床工作中，患兒血漿的CBZ、PT濃度快速監(jiān)測。

【關(guān)鍵詞】卡馬西平；苯妥英鈉；UPLC；血藥濃度

【中圖分類號】R748【文獻標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2015）03-0025-03

癲癇是中國神經(jīng)系統(tǒng)疾病中僅次于腦血管疾病的第二大頑癥，也是一種由多種原因引起的慢性、反復(fù)發(fā)作神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病，藥物控制仍是當(dāng)前主要的治療手段[1]。CBZ是一種優(yōu)秀的抗癲癇藥物； PT是治療癲癇大發(fā)作和局限性發(fā)作的首選藥物。但由于二者具有自身誘導(dǎo)作用，體內(nèi)處置過程復(fù)雜，治療劑量范圍窄（CBZ和PT有效濃度范圍分別為4～12和10～20μg/mL），療效及毒性與血藥濃度關(guān)系密切，且患者間個體差異很大，長期服用不良反應(yīng)較多，易產(chǎn)生耐藥性，因此對其體內(nèi)血藥濃度進行監(jiān)測十分必要[2]。監(jiān)測方法有高效液相法、熒光偏免疫法及酶增強免疫法。免疫法操作簡單，但試劑價格昂貴，專一性差。HPLC準(zhǔn)確、專屬性強、重現(xiàn)性好，可同時測定多種藥物及其代謝產(chǎn)物[3]。本文建立了UPLC法測定CBZ和PT血藥濃度方法，并調(diào)查統(tǒng)計其在兒科臨床應(yīng)用情況，觀察藥物對兒童是否產(chǎn)生不良反應(yīng)。

1UPLC法測定藥物濃度含量方法建立

11儀器、試劑和色譜條件

111儀器、試劑Waters-ACQUITY-UPLC超高效液相色譜儀 （Waters，美國）；Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Sartorius BT125D電子天平（德國賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；MULTIFUGE X1R超高速離心機（Thermo公司，美國）；XW-80A渦旋混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；CBZ對照品（美國sigma公司，批號：344360050）；PT（中國藥品生物制品檢定所，批號：100138-200603）；甲醇：色譜純（美國Fisher公司）；水：自制超純水（水機，英國PURELAB ELGA公司）。

112色譜條件色譜柱為BEH C18柱（50 mm×21 mm， 17μm； Waters公司）；流速為03 ml·min-1；流動相為甲醇-1%三氟乙酸水溶液（45∶55， v/v）；柱溫為30℃；進樣量：2 μl；檢測波長為254 nm。

12樣品測定

121儲備液的配制取CBZ對照品25 mg和PT50 mg，精密稱定，置5ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得濃度為500（CBZ）和1000 （PT）mg·L-1的儲備液。

122血樣預(yù)處理取血漿200μl，加入乙酸乙酯10 ml，渦旋1 min，高速離心7 min（12000 ×g），取上清液700 μl，吹干后，100 μl甲醇復(fù)溶，2μl進樣分析。

16穩(wěn)定性實驗

161儲備液穩(wěn)定性考察儲備液4℃冷藏保存，分別在1、3、5、7、60d后，配制標(biāo)準(zhǔn)使用液4、50μg/ml直接進樣測定，峰面積RSD低于7%，表明儲備液至少在60d穩(wěn)定。

162血樣穩(wěn)定性考察分別配制高中低濃度的標(biāo)本，-20℃冷凍保存，分別在0、12、24、36h測定，峰面積RSD均低于10%。

2臨床應(yīng)用與結(jié)果統(tǒng)計

21標(biāo)本收集收集昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院（昆明市兒童醫(yī)院）20114～20134癲癇患兒1667例癲癇患兒，有150 例服用CBZ（包括與丙戊酸聯(lián)合用藥31例），PT為37例?；純貉帩舛冗_穩(wěn)態(tài)濃度后，采集樣本，按32測定。

22統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS120軟件對數(shù)據(jù)進行處理。收集白細(xì)胞數(shù)、血小板、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、和膽紅素[2]數(shù)據(jù)，部分結(jié)果以（x±s）表示，P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

23結(jié)果血漿中藥物濃度：CBZ在1～170μg/ml，PT在3～240μg/ml；各組實驗室指標(biāo)中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶值均在正常范圍，其它各項實驗室指標(biāo)與正常兒童參考值P均大于005（表1）； 超聲波檢查，患兒肝臟形態(tài)大小正常，包膜完整，肝實質(zhì)回聲均勻，肝血管清晰可見，其內(nèi)未見異?；芈?；患兒也未出現(xiàn)血液系統(tǒng)及消化系統(tǒng)不良反應(yīng)。

3討論

31UPLC方法色譜條件參考抗癲癇藥物HPLC[2-5]的色譜條件，都不能得到滿意的UPLC色譜圖，減小流動相的極性（減少甲醇比例），二者分離度增加，但PT的色譜峰拖尾，在流動相水中加入酸后，色譜峰有所改善，最終確定流動相為甲醇-1%三氟乙酸水溶液（45∶55）。在本文中，UPLC色譜條件與文獻報道的HPLC色譜條件不大一致可能的原因是二者C18色譜柱填料顆粒粒徑大小不同。

32單個樣本采集量因兒童采血較成人困難，最終確定單個樣本量（血漿）為200 μl，可以獲得理想色譜峰，且采血量易被家長接受，可長期配合醫(yī)生開展治療藥物濃度監(jiān)測。

33癲癇藥物臨床應(yīng)用統(tǒng)計收集1667例癲癇患兒樣本中，只有150例服用CBZ（包括與丙戊酸聯(lián)合用藥31例），PT為37例。可能與下面因素有關(guān)：①與治療藥物有效血藥度范圍寬窄和藥物副作用有關(guān)，如CBZ和PT比丙戊酸范圍要窄得多，故大部分醫(yī)生和家長選擇丙戊酸，以便于更好控制患兒服藥劑量；②類似藥物心理效應(yīng)[6]，“家長藥物心理效應(yīng)”影響癲癇患兒長期用藥的種類，如在家長配合醫(yī)生治療孩子癲癇疾病時，給孩子用藥易受到外界暗示（受到醫(yī)生、網(wǎng)絡(luò)、廣告和書籍等），相對于CBZ和PT，家長對丙戊酸治療癲癇更有藥物認(rèn)同感和更愿意選擇丙戊酸治療孩子疾病。

34實驗室檢查和超聲檢查均未見報道不良反應(yīng)[2]，可能與樣本量小有關(guān)。

參考文獻

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[3] 程振田， 郭瑞臣， 王本杰， 等. HPLC測定人血清苯巴比妥卡馬西平、苯妥英鈉濃度及其與FPIA法測定結(jié)果的比較[J].中國藥學(xué)雜志，2008， 43（12）：950-954.

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（收稿日期：20141112）