劉良燚　劉凱　張景石　李木衛(wèi)　王瑒

【摘 要】 目的：比較經(jīng)脫細(xì)胞處理的同種異體神經(jīng)支架修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損與自體神經(jīng)移植修復(fù)效果的區(qū)別。方法：32只SD大鼠隨機(jī)分為2組，每組16只，分別為脫細(xì)胞神經(jīng)支架修復(fù)坐骨神經(jīng)缺損組（A組）和自體移植組（B組）。術(shù)后利用HE染色和透射電鏡觀察支架內(nèi)結(jié)締組織重塑情況和神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果：與自體移植組相比，單純脫細(xì)胞神經(jīng)支架組細(xì)胞分布較紊亂，說(shuō)明支架內(nèi)結(jié)締組織已有增生重塑現(xiàn)象。通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，單純脫細(xì)胞支架組的髓鞘形態(tài)與自體移植組的顯微結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯的差異。結(jié)論：脫細(xì)胞異體神經(jīng)支架異體移植后，能與自體神經(jīng)移植修復(fù)缺損神經(jīng)產(chǎn)生相似的移植效果。

【關(guān)鍵詞】 神經(jīng)支架；神經(jīng)缺損；大鼠

【中圖分類(lèi)號(hào)】R745 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2015）05-0073-02

周?chē)窠?jīng)損傷在臨床上十分常見(jiàn)，尤其長(zhǎng)段距離的神經(jīng)缺損修復(fù)一直是困擾臨床的難題，目前自體神經(jīng)移植的修復(fù)方式是臨床首選[1]。然而自體移植手術(shù)存在供區(qū)有限、供區(qū)感覺(jué)或運(yùn)動(dòng)的失神經(jīng)障礙、神經(jīng)束錯(cuò)位、神經(jīng)活力隨時(shí)間衰減以及無(wú)血管生成能力等問(wèn)題[2-3]，也是目前臨床應(yīng)用無(wú)奈之舉。鑒于此，本研究擬通過(guò)比較同種異體脫細(xì)胞神經(jīng)支架修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損與運(yùn)用自體神經(jīng)移植修復(fù)的效果的差異，以期為異體脫細(xì)胞神經(jīng)支架作為自體神經(jīng)移植替代治療提供部分研究基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

11 儀器 3131型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；H-7650型透射電鏡（日本日立公司）；熒光顯微鏡DM4000（德國(guó)Leica公司）。手術(shù)器械及顯微手術(shù)器械（寧波成和醫(yī)療器械有限公司）。

12 材料 清潔級(jí)雄性SD大鼠，體重（300±42）g，購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2011-0029，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（粵）2011-0112。脫氧膽酸鈉、Triton X-100（美國(guó)sigma公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法

2 1 坐骨神經(jīng)取材 準(zhǔn)備SD大鼠8只，作為制備脫細(xì)胞支架的神經(jīng)供體來(lái)源，先用10%水合氯醛按10ml/kg腹膜浸潤(rùn)麻醉充分后，再用75%酒精溺斃大鼠，并充分浸泡消毒10分鐘，將消毒后的大鼠置于超凈臺(tái)，無(wú)菌操作下逐層解剖雙下肢至顯露雙側(cè)坐骨神經(jīng)，完整切取雙側(cè)坐骨神經(jīng)干，8只大鼠共取出坐骨神經(jīng)16條。

22 神經(jīng)支架的制備 將大鼠坐骨神經(jīng)干在手術(shù)顯微鏡下小心去除神經(jīng)干周?chē)钅ず脱芙M織，并用無(wú)菌PBS緩沖液反復(fù)清洗。在常溫下進(jìn)行如下步驟[4-5]：①在無(wú)菌蒸餾水中靜置6h；②3% TritonX-100中靜置12h；③無(wú)菌蒸餾水漂洗3次，然后用無(wú)菌PBS緩沖液漂洗3次；④4%脫氧膽酸鈉溶液靜置12h；⑤無(wú)菌蒸餾水漂洗3次，然后無(wú)菌PBS緩沖液漂洗3次。上述步驟完成以后得到大鼠脫細(xì)胞坐骨神經(jīng)支架，將該支架置于PBS緩沖液4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

23 動(dòng)物分組與坐骨神經(jīng)缺損橋接實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽?模型制備：按照隨機(jī)的原則將SD大鼠分為：?jiǎn)渭兠摷?xì)胞支架對(duì)照組（A組）和自體移植組（B組），每組16只。常規(guī)消毒術(shù)野，鋪無(wú)菌巾，于后肢外側(cè)中上1/3處做橫行切口，切開(kāi)皮膚約45cm剪開(kāi)筋膜組織，沿肌間隙由淺入深小心的鈍性分離，充分顯露坐骨神干經(jīng)后，快刀切取長(zhǎng)度為15cm的坐骨神經(jīng)。形成右坐骨神經(jīng)干缺損動(dòng)物模型，將脫細(xì)胞神經(jīng)支架在10倍手術(shù)顯微鏡下修剪為長(zhǎng)度15cm，植于坐骨神經(jīng)干缺損處，用10-0無(wú)創(chuàng)縫線，兩定點(diǎn)外膜縫合法吻合坐骨神經(jīng)近端斷端于神經(jīng)支架近端，縫合6針，依法吻合遠(yuǎn)端斷端于神經(jīng)支架遠(yuǎn)端，創(chuàng)面充分止血，關(guān)閉創(chuàng)面。自體移植組以左右兩側(cè)坐骨神經(jīng)干相互交換的方法進(jìn)行，術(shù)中注意標(biāo)記切取神經(jīng)干的遠(yuǎn)近端，以便正確回植。

2 4 神經(jīng)再生的組織學(xué)觀察

241 HE染色 取各組支架中段石蠟包埋切片，行常規(guī)HE染色。觀察再生神經(jīng)中的細(xì)胞、軸突、髓鞘的形態(tài)。

242 超薄切片 透射電鏡觀察再生神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)的變化情況。

3 結(jié)果

3 1 一般觀察 術(shù)后15個(gè)月，兩組營(yíng)養(yǎng)不良性改變均減輕，兩組再生神經(jīng)外觀均接近正常神經(jīng)組織，B組肌肉萎縮程度較A組輕，A組皮膚感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)功能差于B組。術(shù)后2個(gè)月，兩組營(yíng)養(yǎng)不良性改變均減輕，自體神經(jīng)移植組肌肉萎縮程度輕，對(duì)針刺的反應(yīng)敏感度及運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)較好。術(shù)后6個(gè)月，神經(jīng)取材前觀察神經(jīng)外觀情況，兩組神經(jīng)連續(xù)性良好，與周?chē)M織無(wú)明顯粘連，無(wú)纖維神經(jīng)瘤形成，移植段表面均有不同程度的血管化，A組中段較B組略細(xì)，B組形態(tài)結(jié)構(gòu)基本接近正常神經(jīng)組織。

32 神經(jīng)支架的光鏡觀察 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的移植物段及其兩端未見(jiàn)肉芽組織，在其橫切面上移植物中段顯示大量的再生神經(jīng)纖維集合形成許多由束膜包繞的神經(jīng)束，并有完整的外膜包裹，兩組之間在光鏡觀察無(wú)明顯差異。

3 3 神經(jīng)支架的HE染色分析 由蘇木素-伊紅染色結(jié)果可見(jiàn)圖1，在移植物遠(yuǎn)段神經(jīng)組織橫切片上，單純脫細(xì)胞神經(jīng)支架組、自體神經(jīng)移植組標(biāo)本均可見(jiàn)成束狀排列的神經(jīng)樣組織、藍(lán)染的細(xì)胞核、新生毛細(xì)血管及少量的纖維組織增生，說(shuō)明神經(jīng)纖維已經(jīng)生長(zhǎng)至遠(yuǎn)端。此外，自體神經(jīng)移植組組細(xì)胞排列較為整齊，細(xì)胞核走形較為一致，單純脫細(xì)胞神經(jīng)支架組細(xì)胞分布較紊亂，細(xì)胞核走形較為混亂，說(shuō)明脫細(xì)胞支架內(nèi)結(jié)締組織增生重塑現(xiàn)象明顯。

3 4 神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)分析 由圖2可見(jiàn)，兩組神經(jīng)纖維內(nèi)均可見(jiàn)數(shù)條神經(jīng)軸突纖維，軸突滿(mǎn)布髓鞘，在軸突內(nèi)可見(jiàn)大量微絲、微管、新生毛細(xì)血管，細(xì)胞器豐富，軸突外有髓鞘包裹，髓鞘呈類(lèi)圓形或不規(guī)則形，髓鞘壁厚薄均勻，可見(jiàn)同心圈層，髓鞘外周均有雪旺細(xì)胞胞質(zhì)，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，胞核基本規(guī)整。兩組超微結(jié)構(gòu)無(wú)十分明顯的差異。

4 討論

周?chē)窠?jīng)長(zhǎng)距離缺損的修復(fù)一直是臨床難題，自體神經(jīng)移植被認(rèn)為是修復(fù)周?chē)窠?jīng)缺損的金標(biāo)準(zhǔn)[5]。因自體神經(jīng)來(lái)源有限以及增加了手術(shù)部位和創(chuàng)傷造成該神經(jīng)支配區(qū)的功能障礙，常無(wú)法滿(mǎn)足較大神經(jīng)缺損或較廣泛神經(jīng)損傷修復(fù)的需要。近年來(lái)有實(shí)驗(yàn)表明[6-7]，脫細(xì)胞的同種異體天然神經(jīng)支架優(yōu)于其他人工制備的支架，不僅在于有較好的組織相容性，主要還在于去除有抗原性的細(xì)胞和髓鞘， 而保留了抗原性極小的基底膜作為支架引導(dǎo)軸突沿移植物內(nèi)管向遠(yuǎn)端生長(zhǎng)，引導(dǎo)宿主許旺細(xì)胞沿其內(nèi)管壁向移植段遷移和增殖，避免或極大地減輕宿主的免疫排斥反，使軸突再生通過(guò)一段較長(zhǎng)距離成為可能。同時(shí)獲得以施萬(wàn)細(xì)胞基底膜管（SCBL）為主的神經(jīng)外基質(zhì)構(gòu)成的三維管狀支架材料。軸突再生的研究表明，SCBL是由含豐富層黏蛋白（LN）的細(xì)胞外基質(zhì)組成，它能夠促進(jìn)宿主施萬(wàn)細(xì)胞向神經(jīng)移植段內(nèi)遷移，引導(dǎo)軸突沿著SCBL的內(nèi)面生長(zhǎng)[8]。

本實(shí)驗(yàn)大體組織觀察發(fā)現(xiàn)：脫細(xì)胞神經(jīng)移植段周?chē)M織黏連及瘢痕形成較輕微，神經(jīng)連續(xù)性良好，無(wú)移植段吸收現(xiàn)象。說(shuō)明脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)與自體神經(jīng)一樣，是良好的神經(jīng)缺損橋接修復(fù)材料，光鏡觀察發(fā)現(xiàn)脫細(xì)胞神經(jīng)移植段中央顯示大量的再生神經(jīng)纖維集合形成許多由束膜包繞的神經(jīng)束，并有完整的外膜包裹，出現(xiàn)大量髓鞘形成的早期像，軸索位于橢圓形施萬(wàn)細(xì)胞的一側(cè)。

經(jīng)3% Triton X-100和4%脫氧膽酸鈉萃取的脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)支架，其神經(jīng)修復(fù)過(guò)程未表現(xiàn)出對(duì)大鼠機(jī)體及周?chē)M織的毒性及炎癥刺激，新生神經(jīng)軸突微管、微絲、毛細(xì)血管、細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)，髓鞘可見(jiàn)同心圓狀板層結(jié)構(gòu)，雪旺細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，其與自體神經(jīng)移植修復(fù)無(wú)明顯差異。說(shuō)明此種脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)支架有作為神經(jīng)缺損修復(fù)的橋接物的潛力，可作進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Gregory H，Borschel，Kevin F Kia，et al.Mechanical Properties of Acellular Peripheral Nerve[J].Journal of Surgical Research，2003，114：133-139.

[2] Tasuo Nakamura，Yuji Inada，Seijun Fukuda，et al.Experimental study on the regeneration of peripheral nerve gaps through a polyglycolic acid collagen （PGA collagen） tube [J].Brain Research，2004，1027：18-29.

[3] KunjorT，Hirohito FT，Akira T，et al.Basic behavior ofmigratorySchwann cells in peripheral nerve regeneration[ J].Exp Neuro，1996，137（2）：301-3081.

[4] 許揚(yáng)濱，胡軍，江長(zhǎng)青，等.去細(xì)胞同種異體神經(jīng)構(gòu)建獼猴組織工程化神經(jīng)的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華顯微外科雜志，2005，28（2）：136-138.

[5] 高嵩濤，鄧展生，李寶軍，等.不同去細(xì)胞神經(jīng)支架制備方法的對(duì)比研究[J]中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2008，10（7）：851-855.

[6] Flores AJ，Lavernia CL，Owens PW.Anatomy and physiology ofperipheral nerve injury repair[J].Am JOrthop，2000，29（3）：167-1731.

[7] DumentCE，HentzVR.Enhancement of axon growth by detergent-extracted peripheral nerve grafts[J].Transplantation.1997，63（8）：1210-12151.

[8] 佟曉杰，劉承吉，張彩順，等.脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植物修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究[J].解剖學(xué)報(bào)， 2004，35（3）：230-233.

[9] WangGY，HiraiKI，ShimadaH.The role of laminin，a componentofSchwann cellbasal lamina，in rat sciatic nerve regenerationwithantiserum-treated nerve grafts[J].Brain Res，1992，570（11）：116-1251.

（收稿日期：20141211）