和勝菲等

【摘 要】 目的：采用高效液相色譜法測定并分析不同提取溫度對五倍子中單寧酸、五沒食子?；咸烟?、沒食子酸含量的影響。方法：以醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH40）為提取溶劑（液料比1∶100），分別在65、75、85、95℃中水浴35h，HPLC法測定含量。結果：在85℃溫度提取條件下，三者可測得最大含量。結論：本實驗初步提示提取五倍子中單寧酸、五沒食子?；咸烟恰]食子酸的最佳提取溫度為85℃，可為五倍子的實驗研究和工藝研究提供一定參考。

【關鍵詞】 五倍子；提取溫度；單寧酸；五沒食子?；咸烟牵≒GG）；沒食子酸；HPLC

【中圖分類號】R2841 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2015）05-0028-02

Different extraction temperatures gallnut main chem ical components of HPLC

HE Sheng-fei ZHOU Guo-li ZHENG Shi-ping WANF Fen FAN Yuan*

Yunnan University of TCM，Kunming 650500，China

Abstract：Objective To measure and analysis the influence of different extract temperature on the content of tannic acid，gallic acid and 1，2，3，4，6-Penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose （PGG） in Chinese gall by using high performance liquid chromatography.Methods With sodium acetate acetic acid buffer soiution （pH4） as the extraction solvent（liquid rate 1∶100），respectively at 65℃，75℃，85℃，95℃ water bath in 35h，using HPLC to measure and analysis the extraction of tannic acid，PGG，gallic acid from Chinese gall.Results The content of three are highest on condition of 85℃.Concludes The experiment preliminary suggest extraction temperature of annic acid，PCC，gallic acid from Chinese gall is 85℃，it can provide some reference for the research of experiment and pross of china gall.

Keywords：Chinese gall；extraction temperature；tannic acid；PGG；gallic acid；HPLC

五倍子是我國的傳統(tǒng)中藥，已有幾千年的歷史，廣泛用于抗菌、抗病毒、防齲齒、抗氧化、抗癌、抗糖尿病、止瀉、消炎和抗凝血酶等[1]。我國五倍子產量約占世界總產量的95%，國際上又把五倍子稱為中國五倍子[2]。五倍子中的主要有效成分為鞣質及沒食子酸，五倍子中的單寧酸和五沒食子?；咸烟牵≒GG）是水解類鞣質[3]。

五倍子中含量最多的成分是五倍子單寧，單寧又名鞣酸、單寧酸，含量約70%，甚至可高達80%[4]。五倍子單寧具有β-五-O-沒食子酸-D-葡萄糖（β-PGG），另外還含8～9個沒食子酸[5]，分子式為C76H52O46，結構如圖1所示。五沒食子?；咸鞘翘烊欢喾宇惢衔?，是由葡萄糖與5個沒食子酸形成的酯[6]，是五倍子鞣質的原型和化學反應的中間途徑[7]，分子式為C41H32O26，結構如圖2所示。沒食子酸（Gallic acid）亦稱五倍子酸或棓酸，在五倍子中約含2%～4%[8]，是天然的多酚類化合物，化學名3，4，5-三羥基苯甲酸[9]，分子式C7H6O5，結構如圖3所示。

五倍子作為傳統(tǒng)中藥有廣泛應用價值，為更好的利用五倍子的資源，其各有效成分的提取成為研究熱點，本文測定并分析提取溫度對其活性成分中單寧酸、五沒食子?；咸烟?、沒食子酸的影響。

1 材料與試劑

11 儀器 Agilent1200型高效液相色譜儀（VWD檢測器）；電熱恒溫干燥箱DHG-9071（上海精宏實驗設備有限公司）；高速多功能粉碎機XY-500A型（浙江省永康市松青五金廠）；分樣篩（浙江上虞市五四建材儀器廠）；分析天平；電子天平；恒溫水浴鍋。

12 試劑 單寧酸對照品（成都邁斯克醫(yī)藥科技有限公司）；PGG對照品（四川成都普瑞法有限公司）；沒食子酸對照品（購自云南省藥檢所）；甲醇、乙腈均為色譜純；水為純凈水；其余試劑為分析純醇。

五倍子（購自昆明道地中藥飲片廠）敲碎，除去蟲癭，清洗，烘干，粉碎，過五號篩密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

21 色譜條件

211 單寧酸色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB- C18柱（46×250mm，5μm）；流動相：純凈水（A）-甲醇（B）（20∶80）；流速：05ml/min；檢測波長：275nm；柱溫：25℃；進樣量：2μl。

212 PGG色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB- C18柱（46×250mm，5um） 流速：10ml/min；流動相：01%磷酸（A）-乙腈（C）（90∶10），進行梯度洗脫，0～15min，10%～25%C、15～1510min，25%C、1510～20min，25%C；檢測波長：280nm；柱溫：25℃；進樣量：20μl。

213 沒食子酸色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB- C18柱（46×250mm，5μm） 流動相：02%磷酸（A）-甲醇（B）（95：5） 流速：1ml/min；檢測波長：273nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10μl 。

22 對照品溶液制備

221 單寧酸對照品溶液制備 精密稱取單寧酸標準品044mg置于10ml容量瓶中，用50%的甲醇溶解定容至刻度，搖勻作為儲備液。

222 PGG對照品溶液制備 精密稱取PGG標準品045mg，用80%甲醇溶解定容于10ml容量瓶中，搖勻即得。

223 沒食子酸對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸標準品25mg置于10ml容量瓶中，再加入7ml乙醇、29ml水和01ml丙酮定容至刻度，搖勻即得。

23 供試品溶液制備 用電子天平精密稱取4份02g五倍子粉末于4個250ml具塞錐形瓶中，加入20ml配好的pH40醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，分別置于65、75、85、95℃恒溫水浴鍋中水浴加熱水解35h，冷卻過濾，精密量取濾液1ml于10ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻即得。

24 標準曲線繪制

241 單寧酸標準曲線制備 精密稱取單寧酸標準品258μg置于10ml容量瓶中，用乙醇、水、丙酮體積比為699%、298%、03%的溶液溶解并定容至刻度，搖勻。按“211”單寧酸色譜條件分別取2、4、6、8、10μl不同體積進樣，以單寧酸的峰面積（Y）對標準品的質量（X）進行線性回歸，得方程y=57195x-19248（r=09974），結果表明：單寧酸峰面積值與質量有良好的線性關系，線性范圍為0516～258μg。

242 PGG標準曲線制備[10] 精密稱取單寧酸標準品8mg置于50ml容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻。從中精密吸取10ml于25ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。按“212”PGG色譜條件分別取2、4、6、8、10、15μl不同體積進樣，以PGG標準品質量為橫坐標（X），峰面積峰值為縱坐標（Y），得回歸方程為：Y=2420237X-18445（r=09998），表明PGG在0139～10428μg范圍內線性關系良好。

243 沒食子酸標準曲線制備 精密稱取沒食子酸標準品25mg置于25ml容量瓶中，用50%的甲醇溶解定容至刻度，搖勻。分別精密吸取01、05、1、2、4ml于10ml容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即配制成濃度為1、5、10、20、40μg/ml的標準溶液。按“213”沒食子酸色譜條件進樣20μl，以沒食子酸的峰面積（Y）對其濃度（X）進線性回歸，得方程Y=1147X+24554（r=09999），結果表明：沒食子酸峰面積值與濃度有良好的線性關系，線性范圍為1～10μg/ml。

25 含量測定 分別取“23項”下方法制備的供試品溶液，按“21”色譜條件分別測定單寧酸、五沒食子?；咸烟呛蜎]食子酸含量，用外標法進行計算。

3 結果

由表1可知，在85℃時單寧酸、五沒食子?；咸烟牵≒GG）和沒食子酸可測得最大含量。上述結果顯示：85℃為單寧酸、五沒食子?；咸烟牵≒GG）和沒食子酸的最適提取溫度，并且五沒食子?；咸烟呛蜎]食子酸含量變化受溫度影響較單寧酸大。

4 討論

中藥成分復雜，在提取過程中應該盡可能多的提取出其有效活性成分，而在此過程中液料比、提取溶劑種類、提取溫度、pH值等都可能會影響其含量。在五倍子中，單寧酸的提取方法主要有溶劑提取法、超聲輔助法、加壓提取法、超臨界CO2萃取法，沒食子酸提取有酸水解法、堿水解法和酶水解法，而五沒食子?；咸烟侵饕獮榇冀夥╗11]。

本實驗以醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH40）為提取溶劑，用HPLC法測定分析不同提取溫度下提取液中單寧酸、五沒食子?；咸烟呛蜎]食子酸的含量變化，以期獲得最佳的提取溫度。結果表明在85℃時五倍子中單寧酸、五沒食子?；咸烟呛蜎]食子酸可測得最大含量，結果提示單寧酸含量變化受溫度影響比五沒食子酰基葡萄糖和沒食子酸小。測定并分析不同溫度對五倍子中單寧酸、五沒食子?；咸烟呛蜎]食子酸的影響可為五倍子的工藝研究及進一步開展實驗研究提供參考依據。

參考文獻

[1]Xue-Lian Huang，Ming-Dong Liu，Ji-Yao Li，et al.Chemical composition of Galla chinensis extract and the effect of its main component（s） on the prevention of enamel demineralization in vitro[J].International Journal of Oral Scienc，2012，4（3）：146-151.

[2]李志國，楊文云，夏定久.中國五倍子研究現狀[J].林業(yè)科學研究，2003，16（6）：760-767.

[3]趙勇，王紅，王寶恩，等.中藥水解類鞣質PGG的研究進展[J].臨床和實驗醫(yī)學雜志，2013，12（6）：462-464.

[4]張雅麗，李建科，劉柳，等.五倍子單寧對常見食品腐敗菌和致病菌抑制作用研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34（18）：141-143.

[5]江凱.五倍子單寧提取純化及生理活性的研究進展[J].農產品加工·學刊，2013，（5）：53-56.

[6]Jinhui Zhang，Li Li，Sung-Hoon Kim，et al. Anti-Cancer， Anti-Diabetic Other Pharmacologic Biological Activities of Penta-Galloyl-Glucose[J].Pharmaceutical Research，2009，26（9）：2066-2080.

[7]Makoto Nishizawa，Takashi Yamagishi.Novel hydrolysable tannins from Nuphar Japonicum DC[J].Chemical and Pharmaceutical Bulletin，1982，30（3）：1094-1097.

[8]喬彩云，李建科.五倍子及五倍子單寧的研究進展[J].食品工業(yè)科技，2011，32（7）：458-462.

[9]張雅麗，李建科，劉柳，等.五倍子沒食子酸研究進展[J].食品工業(yè)科技，2013，34（10）：386-390.

[10]李霄，艾萍.RP-HPLC雙波長法測定白芍中芍藥苷和五沒食子酰葡萄糖含量[J].北京中醫(yī)藥大學學報，2009，32（2）：122-124.

[11]Lili，AhmadAli，Shaik，et al. Preparation of penta-O-galloyl-β-d-glucose from tannic acid and plasmapharmacokinetic analyses by liquid–liquid extraction and reverse-phase HPLC[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2011，54（2）：545-550.

（收稿日期：20141203）