佟玉風(fēng)等

【摘 要】 目的：研究肋柱花水煎液在D-GlaN致急性肝損傷模型大鼠尿液中的化學(xué)成分。方法：采用腹腔注射D-GlaN制備急性肝損傷大鼠模型；利用液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)模型大鼠灌胃肋柱花水煎液后尿液中化學(xué)成分進(jìn)行分析，檢測波長280nm；流動(dòng)相為甲醇-01%甲酸水溶液；流速10ml/min；柱溫35℃；梯度洗脫，質(zhì)譜定性采用多級(jí)離子阱質(zhì)譜，負(fù)離子模式掃描。結(jié)果：在含藥尿液中共標(biāo)識(shí)19個(gè)峰，1個(gè)為藥物原型成分，14個(gè)為代謝產(chǎn)物，其余為尿液內(nèi)源性成分。結(jié)論：該方法較全面的分析肋柱花在急性肝損傷模型大鼠尿液中的化學(xué)成分，為進(jìn)一步研究肋柱花藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 肋柱花；液質(zhì)聯(lián)用；急性肝損傷模型；尿液

【中圖分類號(hào)】R2841 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2015）05-0012-03

Chemical composition analysis of Herba Lomatognii in the urine from ratmodel of D-GlaN induced acute liver injury by LC-MS

TONG Yufeng，BA Genna，BAI Meirong，BAO Minglan，YE Rigui

Inner Mongolia University for the Nationalities，TongLiao 028000，China

Abstract：[WTHZ]Objective[WTBZ] To analyze the chemical composition of Herba Lomatognii water decoction in the urine from rat model of D-GlaN induced acute liver injury.[WTHZ]Methods[WTBZ] Intraperitoneal injected D-GlaN to prepare rat model of acute liver injury；Analyze the chemical composition of the urine after the rats were given Herba Lomatognii water decoction by gavage；The detection wavelength was 280nm；the mobile phase was methanol and water；the flow rate was 10ml/min；column temperature was 35℃；gradient elute.[WTHZ]Results[WTBZ] 19 compositions were detected in the Medicated urine，1 ones were drug-induced compositions，14 ones were metabolites，and others were the natural ingredients for urine.[WTHZ]Conclusion[WTBZ] This method comprehensively analyzed the chemicalcomposition of Herba Lomatognii in the urine from rat model of D-GlaN induced acute liver injury. This research is a theoretical indication for the further research on effective substance of Herba Lomatogonii.

Keywords：Herba Lomatogonii；LC-MS；Acute liver injury model；Urine

肋柱花為龍膽科肋柱花屬植物肋柱花Lomatogonium rotatum（L）Fries ex Nym的干燥全草。廣布在我國西藏、云南、四川、青海、甘肅、新疆、內(nèi)蒙、山西和河北。該藥是蒙醫(yī)特色藥材，具有平息協(xié)日、清熱、健胃、愈傷之功。主要用于清協(xié)日熱、瘟疫、流感、傷寒、中暑頭痛、肝膽熱、黃疸、胃協(xié)日、傷熱等病癥[1]。1998年收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（蒙藥分冊(cè)）。近年來，研究資料顯示，肋柱花所含黃酮類化合物、木犀草素、齊敦果酸等均具有不同程度的利膽、保肝活性[2]，在一定程度上提示肋柱花可用于治療肝膽疾病。

課題組對(duì)該藥材乙酸乙酯、氯仿、正丁醇及石油醚提取物化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，并發(fā)現(xiàn)了新化學(xué)成分[3-6] 。本研究通過灌胃給予D-GlaN致急性肝損傷模型大鼠肋柱花水煎液，收集24h的尿液樣品，通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對(duì)色譜峰歸屬進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究肋柱花藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

11 儀器 Agilent 1100 series LC-MSD 液質(zhì)聯(lián)用儀（包括：Agilent SL 型多級(jí)離子阱質(zhì)譜儀、低壓四元梯度泵、DAD二級(jí)管陣列檢測器、自動(dòng)進(jìn)樣、柱溫箱、chemistation化學(xué)工作站）；Agilent 1260 Infinitely半制備高效液相色譜儀（美國安捷倫）；TGL-20B高速離心機(jī)；KQ-200VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器；AUW120D電子分析天平；DP-01無油真空泵；過濾器和普通玻璃儀器等。

12 藥物和試劑 肋柱花藥材（興安盟左翼中旗）；木犀草素（批號(hào)：111520-200504）、齊墩果酸（批號(hào)：110709-201206）、獐牙菜苦苷（批號(hào)：0785-200203）購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇、甲酸為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

13 動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar雄性大鼠，體重（200±10）g，由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

2 方法與結(jié)果

21 肋柱花水提物制備 稱取1kg肋柱花，第一次加水量為10倍，煎煮提取15h，第二次加水量為8倍，煎煮提取1h，第三次加水量為6倍，煎煮提取1h，共提取3次，合并3次提取液減壓濃縮，干燥得浸膏，低溫保存待用。

22 體外藥材溶液的制備 精密稱取肋柱花浸膏01177g，置于100ml錐形瓶中，精密加入25ml色譜甲醇，密塞，稱定重量706425g（具塞），超聲40min后放冷，再稱定重量，用色譜甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，精密吸取上液1ml過045μm微孔濾膜，得待測溶液。

23 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取獐牙菜苦苷11mg、木犀草素12mg、齊墩果酸1mg，分別置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，取1ml上清液，過045μm微孔濾膜，得標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

24 色譜條件 色譜柱：Venusil MP C18（46×300mm，5μm）；流動(dòng)相：A為01%甲酸水溶液，B為甲醇；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：30μl；流速：10ml/min；檢測波長：280nm，梯度洗脫。如表1。

25 質(zhì)譜條件 電離源：電噴霧離子源（ESI）；檢測方式：負(fù)離子檢測；掃描范圍：m/z 50～800；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流量90L/min；霧化氣壓強(qiáng)：024MPa（350psi）；毛細(xì)管電壓：4000V。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Data Analysis軟件處理。

26 D-GlaN致急性肝損傷模型的復(fù)制[7] 選取大鼠16只，按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組和模型組，模型腹腔注射300mg/kg D-GlaN 24h后處死小鼠，觀察血清AST、ALT含量，正常對(duì)照組腹腔注射300mg/kg生理鹽水，判斷模型是否成功。

27 尿液樣品的收集 取Wistar雄性大鼠15只，隨機(jī)分為空白組，模型組，模型加肋柱花組，每組各5只。將大鼠正常飼養(yǎng)3d使其適應(yīng)環(huán)境，從第4天開始模型加肋柱花組按54g/kg劑量灌胃肋柱花水煎液，空白組和模型組灌胃等容量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)7d，于末次給藥后1h，模型組和模型加肋柱花組大鼠按照300mg/kg腹腔注射D-GlaN進(jìn)行造模。將各組大鼠置于代謝籠中，分別收集24h尿液，將尿液置于-40℃冰箱備用。

28 尿液樣品的預(yù)處理[8]

281 乙酸乙酯萃取法 將凍存的各組尿液樣品置于室溫下緩慢融化， 12000r/min離心10min，取上清液20ml，每次加2倍量乙酸乙酯，萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮至干，用10ml色譜甲醇超聲溶解，022μm微孔濾膜過濾備用。

282 SPE小柱固相萃取法 將凍存的各組尿液置于室溫下緩慢溶解， 12000r/min離心10min，取上清液2ml，用HBL固相萃取柱進(jìn)行純化，先用1ml蒸餾水洗去雜質(zhì)，洗脫液棄用；再用2ml甲醇洗脫，減壓濃縮至干，殘?jiān)?ml色譜甲醇溶解，022μm微孔濾膜過濾備用。

283 正丁醇萃取法 將凍存的空白及給藥組尿液樣品置于室溫下緩慢融化，12000r/min離心10min，取上清液20ml，每次加2倍水飽和的正丁醇溶液，萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮至干，用10ml色譜甲醇超聲溶解，022μm 微孔濾膜過濾備用。

29 液質(zhì)聯(lián)用圖譜測定 分別吸取空白尿液、模型尿液、含藥尿液供試品溶液、體外藥材溶液及對(duì)照品溶液各30μl進(jìn)樣，記錄60min的色譜圖。

210 結(jié)果 對(duì)比空白尿液、模型尿液、肋柱花尿液、肋柱花體外藥材HPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)肋柱花尿液共標(biāo)識(shí)19個(gè)成分，結(jié)合保留時(shí)間、紫外吸收和二級(jí)質(zhì)譜分析得知4、8、13、19號(hào)峰為尿液內(nèi)源性成分，15號(hào)峰為藥物原型成分，1、2、3、5、6、7、9、10、11、12、14、16、17、18號(hào)峰推測其為體內(nèi)代謝產(chǎn)物。LC圖譜比較如下圖：

3 討論

31 尿液樣品處理方法的選擇 通過對(duì)比SPE小柱固相萃取法、乙酸乙酯萃取法和正丁醇萃取法液相圖譜，發(fā)現(xiàn)SPE小柱固相萃取法的選擇性好、保留成分多、引入雜質(zhì)量少，對(duì)樣品起到了很好的純化作用，可作為含藥尿液的處理方法。

32 流動(dòng)相和檢測波長的選擇 實(shí)驗(yàn)中分別嘗試了甲醇-水、甲醇-01%甲酸水溶液等不同流動(dòng)相梯度洗脫，對(duì)比發(fā)現(xiàn)甲醇-01%甲酸水溶液作為流動(dòng)相的峰型好，分離度良好，故選擇了甲醇-01%甲酸水溶液梯度洗脫為流動(dòng)相。檢測波長分別測定了210、238、254、280、305nm，其中在280nm波長下基線平穩(wěn)，分離度良好，故選擇了280nm為檢測波長。

33 結(jié)論 課題組前期實(shí)驗(yàn)研究表明肋柱花具有一定的保肝作用[9]，經(jīng)過適當(dāng)途徑給藥后，在體內(nèi)經(jīng)過吸收、代謝等過程最后吸收入血的往往是多個(gè)單體成分形成的有效成分群，其結(jié)構(gòu)既可以是肋柱花的原型成分，也可以是代謝產(chǎn)物或肋柱花中各成分間相互反應(yīng)形成的新成分，還可以是機(jī)體在藥物作用下生成的新的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)。這些物質(zhì)均須以血液為介質(zhì)輸送到靶點(diǎn)才能產(chǎn)生作用，藥物入血后通過腎臟的代謝排泄，由血液進(jìn)入原尿中，外源性成分（肋柱花原型成分及其代謝產(chǎn)物）在尿液中的含量一般情況下都要高于在血漿中的含量，所以，通過分析尿液中的化學(xué)成分，闡明體內(nèi)直接作用物質(zhì)，將成為快速、準(zhǔn)確的研究肋柱花藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的有效方式。本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜/離子阱質(zhì)譜（LC / MSD Trap）聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合保留時(shí)間、紫外吸收和二級(jí)質(zhì)譜分析，對(duì)肋柱花尿液中化學(xué)成分進(jìn)行了定性分析，共標(biāo)識(shí)19個(gè)峰，1個(gè)成分為藥物原型，14個(gè)成分為代謝產(chǎn)物，其余為尿液內(nèi)源性成分。若要明確其肋柱花尿液化學(xué)成分結(jié)構(gòu)，需通過制備技術(shù)以及核磁共振等其他分析方法來進(jìn)一步研究，以得到明確的結(jié)構(gòu)。

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（收稿日期：20141207）