陶愛群

摘要：為建立‘中秋酥脆棗的組培快繁體系，對外植體消毒時間長短和種類選擇、不定芽誘導、不定芽增殖、不定根誘導進行研究。結果表明：最佳外植體是水培枝棗頭；該外植體用升汞處理5 min后，接種于MS（改良）+6-BA2.5 mg/L+NAA0.15 mg/L，不定芽誘導率達94%；最適增殖培養(yǎng)基為MS（改良）+6-BA 1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L，平均不定芽達6.5；1/2MS（改良）+NAA0.15mg/L為最適生根培養(yǎng)基，不定芽平均生根3.6個。

關鍵詞：‘中秋酥脆棗；組織培養(yǎng)；誘導；增殖

中圖分類號：S665.1 文獻標志碼：A 論文編號：2014-0494

0 引言

‘中秋酥脆棗是祁東糖棗的一個芽變品種，適應南方高溫高濕氣候，抗性強適應性廣，早果豐產性好，品質優(yōu)良，成熟期恰逢中秋、國慶，填補了鮮棗的市場空白，經濟價值極高?！星锼执鄺椧言诤?、江西、廣西、云南、重慶等多個南方省市推廣種植，但其育苗采用嫁接方式，所需的繁殖材料多，且從砧木苗的培育至嫁接苗出圃，至少需要3年以上，耗時長，管理較為困難，使‘中秋酥脆棗在南方的廣泛推廣種植受到了影響。早在1994年王玉國等就對‘駿棗組織與快繁技術進行了研究。迄今為止已有‘駿棗、‘呂西棗、‘桐柏大棗等多個棗樹品種成功再生出完整植株，‘金絲小棗、‘蘋果棗、‘臺灣印度棗、‘毛葉棗等品種建立了組培快繁體系。棗類組培外植體選用了休眠枝、水培芽、帶腋芽莖段、葉片、一年生枝、二次枝、棗頭芽，培養(yǎng)基主要為MS、WP、改良MS、H、White、改良WPM等，啟動培養(yǎng)選用不同濃度的IBA、IAA、NAA、BA、KTt等，繼植物生長調節(jié)劑影響棗的代增殖過程，亦有研究發(fā)現(xiàn)NG在‘臨澤小棗繼代過程中可代替植物生長調節(jié)劑起作用。生根則多采用不同濃度IBA、NAA。雖對棗樹組培快繁有較多的研究，但所有的研究對象均為北方棗品種，對南方廣泛栽種的‘中秋酥脆棗組培技術研究目前沒有報導。為了能在短期內大量生產‘中秋酥脆棗苗，解決苗木生產受季節(jié)、場地限制的問題，筆者擬建立‘中秋酥脆棗組織培養(yǎng)技術體系，為探索其苗木生產的新途徑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

研究田間試驗于2010年在祁東縣新豐果業(yè)公司進行，室內試驗在2011年5月至2013年10月在湖南環(huán)境生物學院組培基地進行。

1.2 外植體篩選與消毒

1.2.1 1年生枝條水培枝 試材采自祁東新豐果業(yè)公司采穗圃。于2010年12月選取生長健壯的1年生枝條放置于氣調庫中貯藏或埋于濕砂中至翌年4月棗芽萌發(fā)前取出，放入純凈水置于人工氣候室中培養(yǎng)，每3天換水1次。采下長1 cm的棗頭、棗股，用洗衣粉水浸泡0.5 h，無菌水沖洗后轉入超凈工作臺，用70%的酒精浸泡30 s，分別用0.1%升汞溶液浸泡1、2、3、4、5 min后無菌水沖洗4～5遍，接種于不含生長調節(jié)劑、蔗糖含量為3%的培養(yǎng)基上，每種材料不同消毒時間均接種40個，20天后統(tǒng)計材料的污染率。

1.2.2 野外1年生枝條2011年5月在祁東新豐果業(yè)公司采穗圃選取生長健壯的當年生棗頭、棗股、二次枝，用流水沖洗后1 h后，再用無菌水浸泡0.5 h。后帶入超凈工作臺上，用70%的酒精浸泡30 s，分別用0.1%升汞溶液2、4、6、8、10 min后無菌水沖洗4-5遍，接種于不含生長調節(jié)劑、蔗糖含量為3%的培養(yǎng)基上，接種數(shù)量同水培枝，20天后統(tǒng)計污染率。

1.2.3 最優(yōu)外植體的篩選 將1年生水培枝新萌發(fā)的棗頭、棗股，1年生棗頭、棗股及二次枝按最優(yōu)消毒方式處理后，每種外植體選50個接種在改良MS+NAA1.00mg/L的培養(yǎng)基上，30天后統(tǒng)計褐化率和啟動率。

1.3 不定芽誘導

1年生水培枝上選取生長健壯的棗頭（長約1 cm）作為外植體，Y1～Y5培養(yǎng)基以改良MSN培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，生長素和細胞分裂素濃度如表1，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶5個，30天后統(tǒng)計啟動率，60天后統(tǒng)計不定芽產生率。

1.4 增殖培養(yǎng)

初代培養(yǎng)出的不定芽，接種于6-BA和NAA濃度（見表1 Z1～Z5）的培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶5個，30天后統(tǒng)計不定芽的再生頻率和生長狀況。

1.5 不定梢生根

選取長2～3 cm，有一定粗度的不定梢接種于表2S1-S6培養(yǎng)基上，10天后轉入不含生長素的1/2MS和1/4MS基本培養(yǎng)上，每種處理接種25瓶，每瓶2個，40天統(tǒng)計不定梢的生根率、生根數(shù)和平均根長。

1.6 其他

本研究中，培養(yǎng)條件均為光照與黑暗16 h/8 h，光強為2000 1x，培養(yǎng)基中均添加7.5 g瓊脂和30 g蔗糖，pH6.0。

2 結果與分析

2.1 外植體消毒與篩選結果

2.1.1 外植體消毒結果 從圖1～2可知，無論是水培枝萌發(fā)棗頭、棗股還是野外一年新生的棗頭、棗股和二次枝，經不同消毒處理后均表現(xiàn)為隨著表面消毒劑處理時間的增長，污染率呈下降趨勢。且消毒處理時間相同時，棗頭污染程度較棗股重，二次枝污染較當年生棗頭、棗股輕，可能是二次萌發(fā)時間較遲，所接觸到的微生物較少。水培枝棗頭、棗股在相同時間消毒劑處理下比采穗圃所采當年生棗頭、棗股輕，應是水培枝放置在人工氣候室中培養(yǎng)時減少了與微生物接觸機會，以它為來源的外植體攜帶的微生物量相應減少。

2.1.2 不同外植體的篩選 水培枝棗頭、棗股5 min，當年生棗頭、棗股、二次枝9 min升汞處理后接種在MS+NAA 1.00 mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天后發(fā)現(xiàn)，6%水培枝棗頭出現(xiàn)褐化，92%材料基部出現(xiàn)不同程度的愈傷化，2%材料在統(tǒng)計時未見有任何反應。從表3中5種材料的表現(xiàn)可見，水培枝棗頭可作為‘中秋酥脆棗不定芽誘導的外植體。

2.2 不定芽誘導與生長

將水培枝棗頭接種于Y1～Y5號培養(yǎng)基上，接種5天后，棗頭基部開始膨大，到15～20天時，可見葉腋處出現(xiàn)不定芽，此芽生長迅速，到30天時部分不定芽已長至1.5 cm長。從表4可知，隨著生長素NAA濃度的升高，棗頭啟動率上升，而不定芽產生率則先上升后下降，以Y4培養(yǎng)基表現(xiàn)最佳。

2.3 不定芽增殖

將先期組培所得的基礎苗中的部分不定芽接種于Z1～Z5的增殖培養(yǎng)基上，30天時統(tǒng)計結果見表5。平均增殖率會隨著生長素和細胞分裂素濃度的升高而增加，平均不定芽長度則為Z4培養(yǎng)基表現(xiàn)較好。綜合快繁對增殖培養(yǎng)階段的要求，以Z4培養(yǎng)基最為適于‘中秋酥脆棗的增殖。

2.4 不定根生長

將2 cm長的不定梢接種于S1-S6號生根培養(yǎng)基上，10天時不定梢基部開始膨大，14～15天時膨大部分出現(xiàn)愈傷組織，20天時愈傷組織中出現(xiàn)小突起，此突起越長越大，30天時可見成形的不定根。從生根情況（表6）看，在0.05～0.15 m/L的濃度范圍內，隨著NAA濃度升高，不定根的產生率、平均生根數(shù)和平均根長均呈上升趨勢。相同濃度的NAA中，1/2MS生根率和平均生根數(shù)高于1/4MS，平均根長則1/4MS表現(xiàn)較好。但總體來說，S3培養(yǎng)最有利于‘中秋酥脆棗組培苗生根。

3 結論

‘中秋酥脆棗組培采用1年生休眠枝條在室內水培后萌發(fā)的棗頭芽作外植體易于進行消毒處理，外植體誘導率高，培養(yǎng)最易獲得成功。MS+6-BA 2.5 m/L+NAA0.15mg∥L是理想的誘導培養(yǎng)基；而為了獲得較理想的增殖倍數(shù)和不定芽生長量，MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L是理想的增殖培養(yǎng)基；在1/2MS+NAA0.15 mg/L培養(yǎng)基上，‘中秋酥脆棗生根良好。以上培養(yǎng)基均添加蔗糖30 gm、瓊脂7.5g/L，pH 6.0。

4 討論

4.1 外植體選擇與滅菌

棗樹組織培養(yǎng)選用莖尖、莖段、棗果、葉片等作為外植體，如雞心棗選用帶腋芽莖段，尜尜棗選用生長季節(jié)棗頭莖段㈣，金絲小棗選用當年生根蘗條水培芽、1年生休眠枝水培芽，酸棗選用休眠枝萌發(fā)的棗頭莖尖均成功再生。筆者試驗表明1年生休眠枝水培后萌發(fā)的棗頭芽是中秋酥脆棗組培的最佳外植體，其原因如下：（1）材料來源較多，冬季進行修剪時會產生大量的1年生枝條；（2）第2年時，該枝條所攜帶的營養(yǎng)充足，同時生理活性較強對生長調節(jié)劑的誘導較敏感；（3）枝條在室內水培時，所接觸的外源微生物相對較少，可以減輕外植體的污染程度，這與代麗等研究㈣結論一致。用棗股芽作外植體培養(yǎng)一段時間后，會萌發(fā)但不能成苗，而選擇棗頭芽作為外植體可形成發(fā)育良好的組培苗，是因為棗頭芽具備有形成樹體骨架和結果枝的潛力，這與尜尜棗研究一致。至于取材時間、取材部位，有待進一步探索。

棗外植體滅菌時，視外植體的污染程度選用不同的消毒方法，消毒時間越長，滅菌效果越好，但外植體受表面消毒劑的傷害也越深，表現(xiàn)為褐化程度增加，誘導率下降，因此滅菌時間長短非常關鍵，應在消毒效果更好的前提下，盡量縮短滅菌時間，選用更有效的消毒劑。筆者采用二次消毒法，能有效殺滅外植體上的外生菌，與冬棗、臺灣青棗類似。‘中秋酥脆棗水培枝棗頭用升汞滅菌5 min綜合效果最好，和雞心棗、青棗相同，短于冬束。

4.2 培養(yǎng)基選擇

棗類進行組培時，基本培養(yǎng)基選用MS、改良MS、H、White、改良WPM，筆者采用改良MS進行‘中秋酥脆棗組培，能有效再生，這應與基因型差異有關。

進行棗類組培時，TDZ、6-BA、ZT等細胞分裂素都用來誘導和增殖不定芽，但研究發(fā)現(xiàn)不同種類的細胞分裂素使用濃度和作用不同，如6-BA在棗類組培上的使用濃度范圍為0.5～5.0 mg/L，TDZ為0.005～0.01 mg/Ltm，6～BA可單獨應用于棗的不定芽誘導，而低濃度TDZ、ZT在棗類不定芽誘導中可與6-BA協(xié)同作用，但不同再生階段作用濃度不同?！星锼执鄺棽欢ㄑ空T導和增殖的最適6-BA濃度分別為2.5、1.5 mg/L，這應是不同棗類品種間基因型的差異導致植物材料內源激素水平差異所致。

NAA、IAA、IBA等生長素均可用于誘導棗類愈傷組織產生、不定芽生長和生根。IBA是一種廣泛應用于棗類組培的生長素，誘導效果好，但IBA售價較高，快繁時應考慮成本問題，故筆者取NAA作為生長素應用于‘中秋酥脆棗的不定芽和生根誘導。