王健勝　賀軍虎　陳華蕊　陳業(yè)淵

摘 要 以來自9個國家或地區(qū)的26份菠蘿種質(zhì)為材料，利用SSR標(biāo)記進(jìn)行了DNA指紋圖譜的構(gòu)建。篩選出多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的8對SSR引物共檢測到35個多態(tài)性位點(diǎn)，每對引物的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)平均為4.38，引物的多態(tài)性條帶百分比平均高達(dá)92.92%，PIC值介于0.26～0.39之間，平均為0.33。利用這8對SSR引物構(gòu)建了26份菠蘿種質(zhì)的指紋圖譜，并對菠蘿種質(zhì)做遺傳相似性分析和聚類分析。結(jié)果表明，菠蘿種質(zhì)遺傳相似系數(shù)分布在0.421～0.974之間，平均為0.689，26份菠蘿種質(zhì)在遺傳相似系數(shù)0.633處被劃分為3類。該研究結(jié)果將為菠蘿種質(zhì)鑒定、分類及分子育種提供重要科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 菠蘿；SSR；指紋圖譜

中圖分類號 S668.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract DNA fingerprints were constructed for 26 pineapple lines originated from nine countries or regions based on SSR marker. Totally， 35 polymorphic alleles were detected using eight SSR primers with the higher polymorphism and the better stability， with an average 4.38 polymorphic alleles for each primer. For SSR primers， the percentages of polymorphic bands to total producing bands reached 92.92%， and the polymorphism information content values varied from 0.26 to 0.39 with an average of 0.33. DNA fingerprints were constructed for 26 pineapple germplasms with the eight SSR primers. The genetic similarity analysis and cluster analysis were also conducted for these pineapple lines， and the genetic similarities coefficient among pineapple lines ranged from 0.421 to 0.974 with an average of 0.689. The 26 pineapple germplasms were divided into three groups at the genetic similarities coefficient of 0.633. These results would provide an important scientific basis for pineapple germplasm identification， classification and molecular breeding of pineapple.

Key words Pineapple； SSR marker； DNA fingerprint

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.07.015

菠蘿[Ananas comosus（L.）Merr]屬鳳梨科鳳梨屬，是一種重要的多年生熱帶水果。菠蘿起源于南美洲，中國菠蘿種植是在國外菠蘿引種的基礎(chǔ)上逐步發(fā)展起來的。一直以來，中國引進(jìn)了大量的菠蘿種質(zhì)，而圍繞這些種質(zhì)有效利用及保護(hù)方面開展的研究甚少，加之國內(nèi)外菠蘿種質(zhì)交流的日益頻繁，使中國菠蘿種植及培育體系較為混亂，因此，開展菠蘿種質(zhì)相關(guān)研究已迫在眉睫。

在菠蘿種質(zhì)研究中，不同菠蘿種質(zhì)的有效區(qū)分是進(jìn)行菠蘿遺傳育種、栽培、種質(zhì)資源保護(hù)等其它研究的重要基礎(chǔ)，而基于傳統(tǒng)表型性狀進(jìn)行菠蘿種質(zhì)研究已表現(xiàn)出越來越多的缺點(diǎn)。利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行DNA指紋圖譜構(gòu)建是目前植物種質(zhì)研究中最為有效的手段，其已在水稻[1]、棉花[2]、棗[3]、玫瑰[4]、木薯[5]、火龍果[6]等植物中得到了較為廣泛的應(yīng)用。目前，多種類型分子標(biāo)記，如AFLP[7]、RAPD[8]、ISSR[9]、SSR[10]、SRAP[11]等已被有效用于植物DNA指紋圖譜構(gòu)建中，其中SSR標(biāo)記技術(shù)由于其具有共顯性好、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好且適合自動化分析等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛采用，因此，國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）在2005年擬定的分子測試指南中將SSR確定為構(gòu)建DNA指紋圖譜的首選標(biāo)記。雖然部分分子標(biāo)記已逐步應(yīng)用于菠蘿研究中，但至今有關(guān)菠蘿DNA指紋圖譜構(gòu)建的報道甚少[12]?；诖耍狙芯坷肧SR技術(shù)構(gòu)建了中國26份菠蘿種質(zhì)的DNA指紋圖譜，以期為菠蘿種質(zhì)的分子鑒定、保護(hù)和科學(xué)利用提供有效技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所利用的26份菠蘿種質(zhì)材料來源于世界上9個不同國家或區(qū)域（表1），主要包括中國臺灣、中國海南、中國廣州、巴西、日本、印度尼西亞、泰國、哥斯達(dá)黎加、毛里求斯。試驗(yàn)材料由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 每份材料隨機(jī)選取10～15個單株幼嫩葉片等量混合，采用改良的SDS法[13]混合提取基因組總DNA，經(jīng)紫外分光光度計測定濃度后，稀釋至適合工作濃度，備用。

1.2.2 SSR標(biāo)記檢測 PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf PCR擴(kuò)增儀上完成，SSR引物見表2。PCR反應(yīng)總體積為20 μL，包括1.0 μL基因組DNA（40 ng），2.0 μL引物（20 mmol/L），2.5 μL 10×PCR緩沖液（含Mg2+），2.5 μL底物dNTPs（2.5 mmol/L），1.0 μL Taq酶（2 U/μL）和11 μL ddH2O。

SSR-PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 2.5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃ 8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用6%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測，待凝膠自然風(fēng)干后進(jìn)行帶型統(tǒng)計。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

以0、1統(tǒng)計SSR擴(kuò)增帶型，在相同遷移率位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，并建立分子數(shù)據(jù)矩陣。計算多態(tài)性位點(diǎn)百分率P/%=（k/n）×100，其中k是多態(tài)位點(diǎn)數(shù)，n為所測位點(diǎn)總數(shù)。SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息量（PIC）按如下公式計算：PIC=1-ΣPi2，式中Pi表示第i個等位位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率。利用NTSYS-pc2.10軟件通過非加權(quán)平均法（UPMGA）計算菠蘿種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性引物的篩選及分析

利用表型性狀差異較大的2個菠蘿材料，即MD2和臺農(nóng)14，對73個菠蘿SSR引物進(jìn)行了篩選，從中篩選出擴(kuò)增位點(diǎn)豐富、帶型清晰穩(wěn)定的多態(tài)性引物20個，選率為27.39%。為了提高指紋圖譜構(gòu)建的效率，研究又從20個多態(tài)性引物中選取8個綜合表現(xiàn)較好的引物用于菠蘿指紋圖譜構(gòu)建，這8個SSR引物詳見表3。從表3可以看出，SSR引物擴(kuò)增的等位位點(diǎn)數(shù)分布在3～6個之間，平均為4.75個，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)目為3～6個，平均為4.38個；同時可以看出，SSR引物多態(tài)性位點(diǎn)百分比都較高，除AY098521、CO730888外，其它引物的多態(tài)性百分比都達(dá)到了100%，平均達(dá)到了92.92%。8個SSR引物的多態(tài)性信息量較高，其變化范圍為0.26～0.39，平均為0.33。其中引物DT338091對26份菠蘿種質(zhì)的擴(kuò)增情況見圖1。

以上分析結(jié)果表明，所選用的8個SSR引物綜合表現(xiàn)都較好，比較適合進(jìn)行菠蘿種質(zhì)DNA指紋圖譜的構(gòu)建。

2.2 菠蘿種質(zhì)遺傳相似性分析

利用8個SSR引物對菠蘿種質(zhì)進(jìn)行了分子檢測，以此為基礎(chǔ)對菠蘿種質(zhì)作遺傳相似性分析（表4）。26份菠蘿種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)的差異較大，其變化范圍是0.421～0.974，平均為0.689。在所有菠蘿種質(zhì)中，來自哥斯達(dá)黎加的MD2分別與來自泰國的Phuket、來自日本的Soft-Touch、來自毛里求斯的Victoria間，以及來自臺灣的金菠蘿與Phuket、Victoria間的遺傳相似系數(shù)最小，只有0.421，說明其親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。另一方面，Bogoul與Honey-Bright，早熟香水與Perola，密寶與臺農(nóng)16，新品系-1與早熟香水、Perola，印尼無刺與新品系、早熟香水、Perola，以及Cacaine與密寶、臺農(nóng)16間的遺傳相似系數(shù)最大，達(dá)到了0.974，表明其親緣關(guān)系相對較近。從26份菠蘿種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)的平均表現(xiàn)來看，中國菠蘿種質(zhì)的遺傳異質(zhì)性相對較好。

2.3 菠蘿種質(zhì)DNA指紋圖譜的構(gòu)建

利用多態(tài)性位點(diǎn)豐富且?guī)颓宄腟SR引物進(jìn)行了菠蘿種質(zhì)DNA指紋圖譜的構(gòu)建，為了提高DNA指紋圖譜的準(zhǔn)確度和精確度，本研究共選用了8個SSR引物，不同菠蘿種質(zhì)DNA指紋圖譜詳細(xì)信息見表5。從表5可以看出，8個SSR引物擴(kuò)增共產(chǎn)生了35個有效基因位點(diǎn)，這35個位點(diǎn)在不同菠蘿種質(zhì)間具有很大的差異，利用其可以有效的將26份菠蘿種質(zhì)進(jìn)行區(qū)分。研究同時發(fā)現(xiàn)，利用多態(tài)性位點(diǎn)比較豐富的單個SSR引物，如DT338091、DT336561，也可以將部分菠蘿種質(zhì)進(jìn)行區(qū)分，但由于其區(qū)分精度相對較差，因此會導(dǎo)致菠蘿種質(zhì)間區(qū)分準(zhǔn)確性的下降，而不同引物多個有效基因位點(diǎn)的結(jié)合將會獲得較為準(zhǔn)確的結(jié)果。

2.4 不同菠蘿種質(zhì)聚類分析

基于SSR標(biāo)記檢測獲得的Nei's遺傳相似系數(shù)，構(gòu)建了26份菠蘿種質(zhì)的遺傳聚類分析圖，結(jié)果見圖2所示。從圖2可見，根據(jù)遺傳關(guān)系的遠(yuǎn)近，將26份菠蘿種質(zhì)大致可被劃分為3個類群，即類群Ⅰ、類群Ⅱ和類群Ⅲ，其中，第Ⅰ類群包含4個菠蘿種質(zhì)，分別來自4個不同的地區(qū)，即泰國、毛里求斯、中國廣州和中國臺灣；構(gòu)成第Ⅱ類群的菠蘿種質(zhì)數(shù)量最多，共有20個，這些菠蘿種質(zhì)包括來自日本的4個、印度尼西亞的3個、巴西的1個、中國臺灣的8個、中國海南的2個和中國云南的2個；第Ⅲ類群共包括2個菠蘿種質(zhì)，分別來自中國臺灣和哥斯達(dá)黎加。

3 討論與結(jié)論

與其它主要農(nóng)作物相比，菠蘿基因組研究較為滯后，而國外內(nèi)開展菠蘿SSR標(biāo)記開發(fā)的研究甚少[15-16]。雖然SSR標(biāo)記數(shù)量較少，但本研究獲得了較為滿意的引物篩選結(jié)果，在選擇的可用于DNA指紋圖譜構(gòu)建的8個核心引物中，多數(shù)引物的多態(tài)性條帶百分比均達(dá)到了100%，引物多態(tài)性條帶百分比平均也達(dá)到了92.92%。SSR引物擴(kuò)增的等位位點(diǎn)也較為豐富，其數(shù)目分布在3～6之間，這種較理想篩選結(jié)果可能與研究所用菠蘿材料存在一定的相關(guān)性，本研究的26份菠蘿種質(zhì)來自世界上9個不同的國家或地區(qū)，而種質(zhì)來源地廣泛性在一定程度上決定了種質(zhì)群體的異質(zhì)性。本研究的SSR標(biāo)記擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)目與童和林等[12]研究結(jié)果存在一定差異，其利用的SSR標(biāo)記擴(kuò)增位點(diǎn)達(dá)到了8～15個，造成這種差異的原因是多方面的，與SSR引物篩選、研究材料差異及帶型統(tǒng)計等都可能有關(guān)，SSR引物的選擇不僅要考慮其擴(kuò)增位點(diǎn)的多少，更要注意該引物在所有研究材料中的擴(kuò)增效果，如果只具有較多擴(kuò)增位點(diǎn)但在部分材料中擴(kuò)增效果不好的SSR引物也不能選作目標(biāo)SSR引物，同時研究材料不同也是導(dǎo)致SSR標(biāo)記擴(kuò)增位點(diǎn)差異的因素之一，另外，SSR擴(kuò)增帶型統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)的不同也會影響擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)量，本研究只對SSR引物擴(kuò)增的主帶進(jìn)行了統(tǒng)計。

在菠蘿DNA指紋圖譜構(gòu)建方面，不同SSR引物也表現(xiàn)出了不同的特性，一般來說，擴(kuò)增等位位點(diǎn)越多的引物其區(qū)分不同菠蘿種質(zhì)的能力相對更強(qiáng)，但通過單個SSR引物構(gòu)建的指紋圖譜無論是在種質(zhì)區(qū)分度還是準(zhǔn)確性方面都會較低，而多個核心引物的聯(lián)合無疑是構(gòu)建DNA指紋圖譜的有效途徑，當(dāng)然它也是目前植物DNA指紋圖譜構(gòu)建普遍采用的基本策略。本研究利用8個核心SSR引物，構(gòu)建了菠蘿種質(zhì)較為理想的DNA指紋圖譜，8個SSR引物所產(chǎn)生的35個有效基因位點(diǎn)可對26份菠蘿種質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確有效的區(qū)分。另外，本研究認(rèn)為，在菠蘿DNA構(gòu)建中，選用SSR標(biāo)記的數(shù)量也甚為關(guān)鍵，因?yàn)槠洳粌H影響著DNA指紋圖譜的準(zhǔn)確性和有效性，它也決定著所能區(qū)分菠蘿種質(zhì)的數(shù)量，而SSR標(biāo)記數(shù)量的確定主要取決于單個SSR標(biāo)記擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)的多少，對某一特定數(shù)量菠蘿種質(zhì)而言，單個SSR標(biāo)記擴(kuò)增位點(diǎn)越多，DNA指紋圖譜構(gòu)建中選用的SSR標(biāo)記數(shù)量則越少。與童和林等[12]研究相比，本研究菠蘿DNA指紋圖譜構(gòu)建中選用的引物數(shù)量較多，其主要原因就是由于本研究所利用的SSR標(biāo)記有效多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)量較低。

在利用SSR標(biāo)記構(gòu)建菠蘿種質(zhì)DNA指紋圖譜的同時，本研究也對26份菠蘿種質(zhì)間的親緣關(guān)系作了初步探討。從聚類結(jié)果可以看出，密寶、臺農(nóng)16和Cacaine間的親緣關(guān)系很近，這與其系譜關(guān)系基本符合，由于密寶和臺農(nóng)16都來自對同一父母本雜交后代個體的選擇，即Cacaine和roguh，該結(jié)果也與竇美安等[17]利用SRAP對菠蘿種質(zhì)的分析結(jié)果基本一致。來自中國廣東的徐利與Phuket、Victoria和臺農(nóng)4號被聚在一起，表明這4個種質(zhì)間具有較近的親緣關(guān)系，徐利很可能來自對其余3個種質(zhì)中某2個種質(zhì)雜交后代的選擇或者對某個種質(zhì)天然變異單株的選擇。新種質(zhì)新品系-1與早熟香水的遺傳相似系數(shù)較高，為0.974，在聚類分析中也被聚為一類，這表明兩種質(zhì)間具有很近的親緣關(guān)系，新品系-1很可能來自對早熟香水后代或變異單株的篩選培育。本研究中部分菠蘿種質(zhì)聚類分析結(jié)果與利用AFLP[18]、SCoT[19]等其它類型分子標(biāo)記的分析結(jié)果基本一致。從遺傳相似系數(shù)來看，26份菠蘿種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)較低，平均為0.689，表明供試菠蘿種質(zhì)的遺傳異質(zhì)性較好，下一步應(yīng)加強(qiáng)部分優(yōu)良種質(zhì)在菠蘿育種中的有效利用研究。

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