牛理達(dá) 趙靜 吳建華

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院皮膚科，上海200433)

在真核生物體內(nèi)有兩種類型的膜蛋白:完整的膜蛋白和脂質(zhì)錨定蛋白。完整的膜蛋白包括一個(gè)或幾個(gè)跨膜區(qū)域，從而構(gòu)成疏水的α-螺旋結(jié)構(gòu)，將蛋白嵌入流動(dòng)的雙分子層中［1］。我們將脂質(zhì)錨定蛋白分為兩組:一組是將蛋白連于內(nèi)部的質(zhì)膜側(cè)，其余的則連于外側(cè)。第1組以鈣調(diào)磷酸酶B為代表，第2組則是一些包含C-末端信號(hào)序列的蛋白通過GPI錨連于細(xì)胞膜上。GPI錨定蛋白 (Glycosylphosphatidylionsitol-anchored protein，GPI-anchored protein)是在真核生物中的一種保守的翻譯后修飾蛋白，如真菌中白念珠菌的GPI錨定蛋白對(duì)真菌細(xì)胞壁的合成和修復(fù)，氧化應(yīng)激的適應(yīng)以及對(duì)機(jī)體的侵襲等發(fā)揮著重要作用;而在哺乳動(dòng)物體內(nèi)GPI錨定蛋白的合成貫穿于胚胎發(fā)育、神經(jīng)發(fā)生、免疫反應(yīng)和受精作用。若GPI錨定蛋白的生物合成途徑受損，將會(huì)導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致胚胎致死。

1 GPI錨定蛋白的結(jié)構(gòu)、修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)

在真菌細(xì)胞內(nèi)的GPI錨定蛋白的N端和C端均有信號(hào)肽，其中C末端為可以有效誘導(dǎo)其與GPI錨結(jié)合，故稱為GPI錨定蛋白的錨定信號(hào)肽，一般為一段不帶電的疏水性的氨基己酸，在靠近C末端9-10氨基酸的位置有GPI結(jié)合位點(diǎn)ω點(diǎn)。蛋白中間由功能集團(tuán)和富含色氨酸/絲氨酸的結(jié)構(gòu)區(qū)域構(gòu)成。N短信號(hào)肽、C端疏水性氨基酸以及靠近C端的ω點(diǎn)被認(rèn)為是GPI錨定蛋白的保守結(jié)構(gòu)域 (見圖1)。

以啤酒酵母菌為代表來詳細(xì)描述一下真菌GPI錨定蛋白 (GPI-anchored proteins，GPI-APs)的修飾與轉(zhuǎn)運(yùn)。在GPI錨與蛋白相連后，與肌醇相聯(lián)的?；湵?Bst1p移除 (PGAP1的同源物)［2］，脂肪酸的移除且被轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上是由Per1p(哺乳動(dòng)物體內(nèi)的PGAP3同源物)介導(dǎo)和Gup1p調(diào)節(jié)的［3］。Ted1p和Cdc1p是哺乳動(dòng)物中PGAP5的同源物，定植于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。有報(bào)道指出，Ted1p對(duì)GPI錨上的乙醇胺-磷酸鹽(Ethanolamine phosphate，Et-NPs)起作用，單鏈的 EtNPs是在 Mcd4p和Gpi7p的作用下添加上去的，而EtNPs是否也在它們的作用下被移除還不得而知［4］。GPI-APs包含一個(gè)長(zhǎng)飽和脂肪酸，以脂肪依賴的方式將特定的蛋白集中和分類至特定的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出口(ER-exit site，ERES)。P24蛋白家族通過在ERES特定的區(qū)域與COPII連接促進(jìn)修飾后的 GPI-APs有效輸出［5］。GPIAPS在運(yùn)至高爾基體后與P24蛋白復(fù)合物家族發(fā)生接力，未發(fā)生修飾的GPI-APs被P24蛋白復(fù)合物通過CPOI由高爾基體回運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (見圖2)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的GPI-APS以不同的形式轉(zhuǎn)運(yùn)至真菌或酵母的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜上。

2 真菌細(xì)胞壁GPI錨定蛋白的結(jié)構(gòu)和功能

真菌的細(xì)胞壁GPI錨定蛋白 (cell wall GPI-anchored proteins，GPI-CWPs)常常高度的磷酸化和糖基化，并且常常參與帶正電離子的綁定［6-7］。蛋白外衣由 β-1、6-葡聚糖、β-1、3-葡聚糖和少量甲殼素構(gòu)成的內(nèi)層的多聚糖層包圍［8］。GPI-CWPs在外層的蛋白外衣通過GPI錨以共價(jià)鍵的方式與β-1，6糖苷鍵相連，同時(shí)依次與 β-1，3-葡聚糖的分子末端相連 (見圖3)。

真菌細(xì)胞壁上的GPI錨定蛋白對(duì)真菌的黏附、形態(tài)轉(zhuǎn)換和細(xì)胞壁合成有著重要的影響，以白念珠菌為例，白念珠菌中的GPI錨定蛋白具有呈家族性出現(xiàn)的特征，通過對(duì)白念珠菌全基因組序列的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)有白念珠菌中的115個(gè)GPI錨定蛋白的編碼基因中有67個(gè)分別屬于不同的基因家族。白念珠菌70%的GPI錨定蛋白的功能未知，但是他們?cè)诤铣珊途S持細(xì)胞壁的完整及侵襲方面有著重要的作用，例如白念珠菌SC5314中的ALS家族中的8個(gè)成員介導(dǎo)了白念珠菌與宿主細(xì)胞的黏附［9-10］。Als3，作為一種侵襲素促進(jìn)白念珠菌被宿主上皮細(xì)胞攝?。?1］，同時(shí)在結(jié)合鐵蛋白螯合鐵方面起到重要作用。菌絲相關(guān)性的Hwp1在介導(dǎo)菌絲形成方面發(fā)揮重要作用，進(jìn)而影響真菌的黏附和侵襲［12］。其他GPI-CWPs在細(xì)胞壁的合成和修飾方面也發(fā)揮作用，例如 Gas/Phr家族［13-14］、Crh家族和Ecm33家族。GPI錨定的天門冬氨酰蛋白酶或天冬酶sap9和sap10也有助于真菌細(xì)胞壁的合成［15］。過氧化物歧化酶 Sod4、Sod5和Sod6被預(yù)測(cè)有潛在的侵襲屬性［15-17］。微生物的黏附是其致病性最重要的決定因素之一，真菌病原體被確定的黏附素很少，來自于白念珠菌的Hwp1、Ala1p/Als5、Als1p和來自于光滑念珠菌的Epa1，他們都隸屬于糖基磷脂酰肌醇依賴的細(xì)胞壁蛋白 (GPI-CWP)［18］，在介導(dǎo)真菌與宿主細(xì)胞之間的黏附過程中發(fā)揮重要作用。

3 哺乳動(dòng)物GPI錨定蛋白的概述以及與真菌GPI錨定蛋白的區(qū)別與聯(lián)系

GPI錨存在于每一個(gè)真核生物體內(nèi)，從單核的酵母細(xì)胞、一些浮游生物的細(xì)胞到高級(jí)的哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，然而很多GPI錨定蛋白如葡糖苷酶、α-淀粉酶、天門冬氨酰酶、超氧化物歧化酶、磷脂酶等的特定功能都無從知曉，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)GPI錨的合成與真菌具有相同的方式，由膽胺、甘露糖、葡糖胺和肌醇在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成以分泌的形式轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜表面，形成 GPI質(zhì)膜蛋白 (Plasma membrance GPI proteins，GPI-PMPs)(見圖 4)，而在真菌體內(nèi)GPI錨定蛋白除了可以錨定于細(xì)胞膜外，其中部分蛋白可以從細(xì)胞膜上脫落，而以共價(jià)鍵的方式與細(xì)胞壁上的β-1，6-葡糖胺相結(jié)合，形成細(xì)胞壁GPI錨定蛋白 (cell wall GPI-anchored proteins，GPICWPs)，哺乳動(dòng)物GPI-APs是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育、免疫反應(yīng)和受精所必需的，人類的一些疾病就是由于GPI錨定蛋白合成過程中的基因突變?cè)斐傻?。有研究指出，在造血干?xì)胞中，PGI-A編碼了GPI錨生物合成的第一種酶，PGI-A主干的突變與陣發(fā)性血紅蛋白尿 (PNH)，一種獲得性的溶血性疾病的發(fā)生有重要關(guān)聯(lián)，此外還有一些報(bào)道指出PIG-M、PIG-V和PIG-N的常染色體隱性突變會(huì)引起遺傳性的GPI錨定蛋白缺陷［19］，從而造成身體發(fā)育過程中嚴(yán)重的缺陷，由此我們可知哺乳動(dòng)物和真菌的GPI錨定蛋白的結(jié)構(gòu)和功能具有很大差異，但是將他們連于細(xì)胞壁或者細(xì)胞膜上GPI錨的合成和核心結(jié)構(gòu)是相似的。

4 展 望

真菌的GPI錨定蛋白是細(xì)胞免疫和體液免疫重要的目標(biāo)，隨著近年來關(guān)于白念珠菌GPI錨定蛋白的研究越來越多，研究人員不再僅僅著眼于某一個(gè)蛋白，而是從整體角度、基因家族角度去研究GPI錨定蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。此外，以GPI錨定蛋白為靶點(diǎn)，篩選出新的新的抗真菌藥物的工作也成為研究方向，一些推測(cè)的如葡聚糖Blg2，Camp65/Scwl和黏附因子Als1和Als3，在白念珠菌病的動(dòng)物模型中利用后3種GPI錨定蛋白可預(yù)測(cè)研制出疫苗［20］。而在哺乳動(dòng)物體內(nèi)GPI錨定蛋白功能廣泛，涉及細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育、分化和程序性死亡等重要生命過程，與許多疾病有著一定的聯(lián)系，如血栓形成、白血病等［21］。由于真菌和哺乳動(dòng)物的GPI錨具有相似的合成部位和核心結(jié)構(gòu)，在研發(fā)作用于GPI錨定蛋白的抗真菌藥過程中，雖然抗真菌GPI錨定蛋白的藥物具有較好的種屬特異性，因此我們推測(cè)對(duì)于真菌GPI錨定蛋白的損傷有可能會(huì)間接影響都真菌GPI錨的功能進(jìn)而可能會(huì)引起一些無法預(yù)測(cè)的藥物的副作用。同時(shí)通過對(duì)真菌細(xì)胞壁蛋白組結(jié)構(gòu)的調(diào)整和動(dòng)態(tài)修飾的研究，在真菌感染宿主時(shí)，我們可以了解細(xì)胞壁成分對(duì)于宿主識(shí)別病原體中的作用。同時(shí)有利于我們研發(fā)新的疫苗、生物標(biāo)記物等，進(jìn)而幫助我們提高一些致病性真菌的診斷和治療。

圖1 GPI錨定蛋白(Glycosylphosphatidylionsitol-anchored protein)核心結(jié)構(gòu)的示意圖［20］ 圖2 啤酒酵母菌細(xì)胞壁上GPI錨定蛋白的修飾與轉(zhuǎn)運(yùn)示意圖［19］ 圖3 GPI錨定蛋白與真菌細(xì)胞壁的連接方式示意圖［20］ 圖4 真核生物質(zhì)膜GPI錨定蛋白和細(xì)胞壁GPI錨定蛋白的位置和結(jié)構(gòu)示意圖［1］Fig.1 The nuclear structure of Glycosylphosphatidylionsitol-anchored protein Fig.2 The modification and transfer of GPI-anchored proteins on Saccharomyces cerevisiae＇s cell wall Fig.3 The connection of between GPI-anchored protein and cell wall in fungi Fig.4 The location and structure between Plasma membrane GPI proteins and Cell wall GPI proteins in eukaryotic cells

綜上所述，不論在真菌還是在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，GPI錨定蛋白作為重要的細(xì)胞表面蛋白，顯示出了重要的研究意義，也開始受到研究人員越來多的關(guān)注。

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