劉原志 章強(qiáng)強(qiáng)

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科真菌室，上海200040)

同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù) (isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)是美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems Incorporation，ABI)在2004年推出的一項(xiàng)功能強(qiáng)大的多肽體外同位素標(biāo)記技術(shù)［1］。該技術(shù)采用4種或8種同位素編碼的標(biāo)簽，通過(guò)特異性標(biāo)記多肽的氨基基團(tuán)及串聯(lián)質(zhì)譜分析，可以同時(shí)比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)水平。自2004年推出以來(lái)，該技術(shù)已被應(yīng)用于細(xì)菌、真菌、人體組織及體液等多種樣本的蛋白質(zhì)鑒定和定量，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及翻譯后修飾研究、基因與蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)分析和細(xì)胞膜與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析等生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用也得到了廣泛關(guān)注。在iTRAQ四標(biāo)試劑基礎(chǔ)上，2007年ABI公司又推出了iTRAQ八標(biāo)試劑，進(jìn)一步增加了檢測(cè)樣本的通量［2］。

真菌的致病作用是多種蛋白質(zhì)共同參與下的真菌-宿主相互作用的復(fù)雜過(guò)程，因此整體、定量地分析真菌致病過(guò)程中的差異表達(dá)蛋白質(zhì)譜，對(duì)于研究真菌的致病機(jī)制具有重要作用。包括iTRAQ技術(shù)在內(nèi)的比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法著重于篩選不同樣本之間的差異蛋白質(zhì)譜，揭示細(xì)胞在生理及病理不同狀態(tài)下的生物進(jìn)程變化，獲得對(duì)某些關(guān)鍵蛋白質(zhì)的定性、定量和功能信息［3］，在真菌致病性及疾病早期診斷等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本文對(duì)iTRAQ技術(shù)在真菌研究中的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1 iTRAQ技術(shù)介紹

1.1 iTRAQ技術(shù)基本原理

iTRAQ技術(shù)是一種新的、功能強(qiáng)大的可以同時(shí)比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)相對(duì)含量或絕對(duì)含量的方法，這種方法是建立在iTRAQ試劑基礎(chǔ)上的［4］。iTRAQ試劑是一種小分子同重元素(isobaric)化學(xué)物質(zhì)，它包括三個(gè)部分:一端為報(bào)告基團(tuán)(reporter group)，中間為平衡基團(tuán) (balance group)，另一端為肽反應(yīng)基團(tuán) (peptide reactive group)。iTRAQ四標(biāo)試劑是由4種相對(duì)分子質(zhì)量分別為114、115、116和117的報(bào)告基團(tuán)，相對(duì)分子質(zhì)量分別為31、30、29和28的平衡基團(tuán)及一個(gè)相同的肽反應(yīng)基團(tuán)組成。不同的報(bào)告基團(tuán)分別與相應(yīng)的平衡基團(tuán)相配后，相對(duì)分子質(zhì)量均為145，即等量異位標(biāo)簽。而iTRAQ八標(biāo)試劑是由8種相對(duì)分子質(zhì)量均為305的等量異位標(biāo)簽分子組成，標(biāo)簽分子由相對(duì)分子質(zhì)量分別為 113、114、115、116、117、118、119和121的報(bào)告基團(tuán)，相對(duì)分子質(zhì)量為192、191、190、189、188、187、186 和 184 的平衡基團(tuán)，以及一個(gè)相同的氨基酸特異性多肽反應(yīng)基團(tuán)組成［5］，由于苯丙氨酸的質(zhì)荷比為120，為了避免對(duì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果造成干擾，八標(biāo)試劑中的報(bào)告基團(tuán)中缺少120。

肽反應(yīng)基團(tuán)將iTRAQ標(biāo)簽與肽段的N-端基團(tuán)和每個(gè)賴氨酸側(cè)鏈相連，可以標(biāo)記所有的酶解肽段。平衡基團(tuán)保證iTRAQ標(biāo)記的同一肽段的質(zhì)荷比相同，因此無(wú)論哪一種iTRAQ試劑標(biāo)記樣本，在第一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)中，不同樣本中的相同蛋白質(zhì)表現(xiàn)為同一質(zhì)荷比。用串聯(lián)質(zhì)譜方法對(duì)第一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)到的前體離子 (Precursor ion)進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，產(chǎn)物離子通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行分析。在二級(jí)質(zhì)譜過(guò)程中，標(biāo)記多肽分解為報(bào)告基團(tuán)、平衡基團(tuán)及氨基酸。報(bào)告基團(tuán)在MS/MS圖上表現(xiàn)為診斷離子(Diagnostic ion)，為iTRAQ技術(shù)蛋白質(zhì)定量的關(guān)鍵，其峰高和面積代表了不同樣本中同一蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度。同時(shí)多肽的酰胺鍵斷裂，形成一系列y-離子和b-離子，通過(guò)查詢數(shù)據(jù)庫(kù)可以鑒定出相應(yīng)的蛋白質(zhì)前體。

1.2 iTRAQ技術(shù)操作流程

以兩個(gè)樣本為例，iTRAQ技術(shù)大致流程如圖1所示，樣品經(jīng)過(guò)還原烷基化、胰蛋白酶酶解得到肽段。將肽段用iTRAQ試劑標(biāo)記，再將標(biāo)記樣本混合，最后用LC-MS/MS進(jìn)行分析。每一個(gè)iTRAQ實(shí)驗(yàn)可得到數(shù)千個(gè)可識(shí)別的多肽和上百個(gè)可鑒定的蛋白質(zhì)。因此，生物信息學(xué)的工具和方法對(duì)于分析這些數(shù)據(jù)必不可少。iTRAQ制造商提供的軟件如Pro Quant、Protein Pilot等可用于分析這些蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)［6］。其他軟件如 Shadforth［7］開(kāi)發(fā)的 i-Tracker等也可用于數(shù)據(jù)分析及解釋。

圖1 iTRAQ技術(shù)操作流程Fig.1 Overview of iTRAQ reagents methodology

1.3 iTRAQ技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

目前，蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用比較成熟的定量方法主要有兩種:一種基于傳統(tǒng)雙向凝膠電泳及染色，另一種基于質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)［8］。目前應(yīng)用比較廣泛的雙向電泳技術(shù)主要是雙向熒光差異凝膠電泳(Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE)。與傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)相比，2D-DIGE雖然準(zhǔn)確性和重復(fù)性更高，但仍不能克服雙向電泳本身的缺陷，如:操作繁瑣;難以與質(zhì)譜直接聯(lián)用，自動(dòng)化程度低;對(duì)于低豐度蛋白、極大蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量＞200 kD)、極小蛋白 (相對(duì)分子質(zhì)量＜8 kD)、極堿性蛋白和疏水性蛋白等難以進(jìn)行有效分離，限制了其應(yīng)用范圍。

基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)可以分為標(biāo)記定量技術(shù)和非標(biāo)記定量技術(shù)兩大類。標(biāo)記定量技術(shù)可通過(guò)使用代謝標(biāo)記、同位素編碼親和標(biāo)簽(isotope-coded affinity tags，ICAT)和在培養(yǎng)過(guò)程中使用穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的氨基酸(stable isotope labeling of amino acids in culture，SILAC)等來(lái)區(qū)別兩種不同樣品的蛋白質(zhì)，再通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行分析比較。其中ICAT技術(shù)目前已得到較廣泛的應(yīng)用，可以精確的分析兩種不同樣品蛋白質(zhì)表達(dá)的差異。其缺陷為:依賴親和素色譜柱可能由于低色譜容量導(dǎo)致樣品損失或不可逆的非特異性結(jié)合造成樣品污染;只能標(biāo)記含有半胱氨酸殘端的蛋白質(zhì)，那些在功能上有重要作用但不含半胱氨酸的蛋白質(zhì)將被遺失［9］。

iTRAQ技術(shù)作為一種新的蛋白質(zhì)定量技術(shù)，比較于傳統(tǒng)技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)為:①由于iTRAQ試劑可以與肽段的N-端基團(tuán)和賴氨酸側(cè)鏈相連，因此幾乎樣本中的所有蛋白質(zhì)均可被標(biāo)記，包括雙向電泳技術(shù)不能檢測(cè)的蛋白質(zhì)，如膜蛋白、疏水蛋白等以及ICAT技術(shù)不能標(biāo)記的含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)［10］。由于每種蛋白質(zhì)有更多的肽段可被分析，提高了蛋白質(zhì)鑒定的覆蓋率和可信度。②可以同時(shí)對(duì)多達(dá)8個(gè)樣本中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量比較，能夠?qū)φＥc疾病、治療前后、疾病過(guò)程、細(xì)胞培養(yǎng)等不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)定性和定量的表達(dá)差異進(jìn)行研究。③iTRAQ試劑可以標(biāo)記修飾后的氨基酸，因此可以對(duì)磷酸化蛋白、糖基化蛋白等翻譯后修飾蛋白進(jìn)行定量和定性研究，從中可以獲得更為詳盡的樣品信息。④iTRAQ試劑的報(bào)告離子為小分子物質(zhì)，因此在質(zhì)譜圖中很容易與其他多肽片段離子區(qū)分，保證了定量的準(zhǔn)確性。⑤標(biāo)記過(guò)程更簡(jiǎn)單，質(zhì)譜檢測(cè)更為靈敏［11］。

同其他蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)一樣，目前iTRAQ技術(shù)仍存在一些缺陷:數(shù)據(jù)復(fù)雜度高，因此需要開(kāi)發(fā)更多的信息學(xué)工具;iTRAQ試劑幾乎可以與樣本中的所有蛋白結(jié)合，容易受樣本中的雜質(zhì)蛋白及樣本處理過(guò)程中緩沖液的污染，需要對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理;iTRAQ試劑仍非常昂貴，這也一定程度上制約了它的廣泛應(yīng)用［12］。

2 iTRAQ技術(shù)在真菌研究中的應(yīng)用

目前蛋白質(zhì)組學(xué)在醫(yī)學(xué)真菌學(xué)中的應(yīng)用主要集中于對(duì)某些真菌雙相性的了解、宿主反應(yīng)、細(xì)胞壁、毒力因子、藥物抵抗等方面，為了解真菌病發(fā)病機(jī)制和藥物開(kāi)發(fā)等打下了基礎(chǔ)［13］。運(yùn)用iTRAQ技術(shù)動(dòng)態(tài)、定量地分析真菌生理、病理不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)的差異表達(dá)譜，對(duì)于分析真菌的致病機(jī)制，探討真菌與宿主的互相作用及尋找新的藥物靶標(biāo)具有重要作用。

2.1 在曲霉研究中的應(yīng)用

為了研究卡泊芬凈 (Caspofungin)對(duì)煙曲霉(Aspergillus fumigams)藥物作用潛在的生物標(biāo)記，Cagas等［14］用iTRAQ技術(shù)比較了藥物作用前后煙曲霉蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，結(jié)果顯示在可溶性和細(xì)胞壁/細(xì)胞質(zhì)膜的蛋白質(zhì)中有471個(gè)蛋白呈特異性表達(dá)。此外，總計(jì)有122個(gè)蛋白的差異表達(dá)水平至少超過(guò)2倍，其中線粒體缺氧反應(yīng)蛋白的差異表達(dá)水平達(dá) 16倍以上。Sunil等［15］運(yùn)用 iTRAQ結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行了黑曲霉 (Aspergillus niger)及其在不同pH條件下突變體的分泌蛋白質(zhì)組學(xué)研究。結(jié)果共鑒定了102個(gè)蛋白質(zhì)，包括許多水解酶，如纖維素酶、半纖維素酶、過(guò)氧化物酶等。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，特定的酶產(chǎn)物可以通過(guò)控制培養(yǎng)基的pH值變化獲得。

2.2 在隱球菌研究中的應(yīng)用

為了找出與生物膜現(xiàn)象相關(guān)的生物信號(hào)分子，從分子水平闡明隱球菌生物膜的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制，賈紅玲［16］從新生隱球菌生物膜狀態(tài)與懸浮狀態(tài)細(xì)胞外泌蛋白方面進(jìn)行iTRAQ比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究。研究共發(fā)現(xiàn)3種差異蛋白分別為:FIP-FVE、Cation-transporting atpase及 Zincmetallopeptidase mde10，其中FIP-FVE是近年來(lái)從一些高等擔(dān)子菌子實(shí)體中提取的與植物凝集素和免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能相似的一類小分子蛋白質(zhì)，其余兩種在真菌蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息還未發(fā)現(xiàn)，具體的功能可能需要參照其他物種的生物學(xué)功能。腐殖隱球菌(Cryptococcus humicola)是一種具有高度鋁耐受性的真菌，為了解其鋁耐受性的遺傳基礎(chǔ)，Jingjing Zhang等［17］運(yùn)用iTRAQ技術(shù)對(duì)腐殖隱球菌經(jīng)過(guò)鋁應(yīng)力影響前后的蛋白質(zhì)學(xué)變化作了研究。共鑒定了625個(gè)蛋白質(zhì)，其中59個(gè)顯著差異蛋白具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨后進(jìn)行蛋白質(zhì)功能研究發(fā)現(xiàn)29個(gè)上調(diào)蛋白主要參與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)構(gòu)成和生物合成等，而30個(gè)下調(diào)蛋白主要參與了能量代謝、翻譯后修飾等。這些功能性的改變有利于保護(hù)細(xì)胞免受鋁毒性損害。

2.3 在鐮刀菌研究中的應(yīng)用

Rebecca等［18］應(yīng)用 iTRAQ技術(shù)研究了禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)在侵犯宿主初期合成并分泌真菌毒素時(shí)的蛋白質(zhì)水平變化，數(shù)據(jù)經(jīng)篩選過(guò)濾發(fā)現(xiàn)共有435個(gè)顯著差異表達(dá)蛋白，其中有72個(gè)上調(diào)蛋白。這些上調(diào)蛋白經(jīng)過(guò)2-D PAGE/MS/MS鑒定，結(jié)果與iTRAQ所得結(jié)果一致。隨后通過(guò)RT-PCR和Northern印跡雜交驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，這些上調(diào)蛋白的編碼基因在真菌毒素合成期轉(zhuǎn)錄活性增高。Amalia等［19］用尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的小分生孢子感染蠟螟幼蟲——一種檢測(cè)固有免疫的無(wú)脊椎動(dòng)物模型，結(jié)合iTRAQ技術(shù)分別研究在25℃和37℃時(shí)控制組和幼蟲免疫組的差異表達(dá)蛋白。共鑒定得到超過(guò)50個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中有17個(gè)可能與免疫相關(guān)，且當(dāng)溫度從25℃升高到37℃時(shí)，一些蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。通過(guò)生物信息學(xué)分析表明，這些免疫相關(guān)差異表達(dá)蛋白參與轉(zhuǎn)運(yùn)、免疫應(yīng)答、氧化還原、分解代謝等進(jìn)程。

2.4 在其他真菌研究中的應(yīng)用

Ross等［1］于 2004年率先用 iTRAQ-MS/MS 技術(shù)比較了野生型啤酒酵母和兩種基因缺陷型突變體的蛋白質(zhì)組，證明該技術(shù)不僅可以提高蛋白質(zhì)組表達(dá)差異分析的覆蓋率，而且可以改善肽鏈斷裂模式。Debra等［20］應(yīng)用iTRAQ技術(shù)分析了兩株不同基因型的釀酒酵母在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的蛋白質(zhì)組學(xué)差異，并進(jìn)行了gene ontology(GO)分析。結(jié)果表明隨著時(shí)間的變化菌株之間的蛋白差異與代謝酶及其相關(guān)基因變化密切相關(guān)，同時(shí)對(duì)兩菌株不同表現(xiàn)型的分子起源提出了假說(shuō)。含油酵母(Oleaginous yeast)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累的特性已被廣泛研究用于生物能源領(lǐng)域。為了研究含油酵母高脂質(zhì)聚集的機(jī)制，Jiahua Shi［21］等應(yīng)用ITRAQ及LC-MS/MS技術(shù)對(duì)一株非含油釀酒酵母及兩株含油酵母進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究。在早期、中期、晚期脂質(zhì)積聚階段，分別有132個(gè)、122個(gè)及116個(gè)蛋白質(zhì)被鑒定，并成功檢測(cè)到脂質(zhì)合成及調(diào)控的相關(guān)必需蛋白。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是通用的、高效的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，廣泛地應(yīng)用于生產(chǎn)和表達(dá)各種外源蛋白。Xiao-qiong Lin等［22］通過(guò)iTRAQ技術(shù)對(duì)3個(gè)甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)xyn10酶菌株(G1、G4、G4-H)進(jìn)行分析，G0菌株作為對(duì)照。對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，鑒定得到1 167個(gè)蛋白質(zhì)，包括352個(gè)差異蛋白。隨后對(duì)差異蛋白進(jìn)行了GO分析和KEGG代謝途徑分析，探究了蛋白表達(dá)的相關(guān)機(jī)制。研究還發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)xyn10酶的調(diào)控基因HAC1會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)造成一定的抑制，蛋白質(zhì)組學(xué)分析可能是由于參與核糖體蛋白表達(dá)的蛋白表達(dá)降低而造成的。包括黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)在內(nèi)的擔(dān)子真菌具有分泌大量氧化水解酶及降解木質(zhì)纖維素類生物質(zhì) (lignocellulosic biomass)的生物特性，對(duì)研究木質(zhì)纖維素生物質(zhì)能具有重要價(jià)值。Arulmani等［23］應(yīng)用iTRAQ結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)黃孢原毛平革菌分別在纖維素、木質(zhì)素及纖維素與木質(zhì)的混合物培養(yǎng)條件下分泌蛋白的差異。結(jié)果共有117個(gè)酶被鑒定。在纖維素和纖維素、木質(zhì)素混合物培養(yǎng)條件下，內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶等顯著上調(diào)且氧化、水解的纖維素被降解。當(dāng)木質(zhì)素為主要碳源時(shí)，銅自由基氧化酶、異戊氧化酶等表達(dá)并顯著上調(diào)。小麥條銹病由專性寄生真菌小麥條銹菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起，在世界范圍內(nèi)廣泛流行。小麥抗條銹病基因WKS1表現(xiàn)出對(duì)條銹病不同生理亞種的廣譜抗性，能有效降低條銹病危害，減少產(chǎn)量損失。李坤等［24］利用iTRAQ技術(shù)，以WKS1基因近等基因系RSL65(含WKS1)和LDN(不含WKS1)為材料，研究不同材料間和接菌前后的差異表達(dá)蛋白，鑒定得到861種蛋白。與LDN接菌前樣品相比，RSL65接菌前、RSL65接菌后、LDN接菌后的3種樣品有58種蛋白均表現(xiàn)顯著差異，其中26種蛋白表達(dá)上調(diào)，32種蛋白表達(dá)下調(diào)。差異表達(dá)蛋白多與細(xì)胞器構(gòu)成、光合作用和轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)，主要參與代謝過(guò)程、信號(hào)傳遞、防御和抗脅迫等生物過(guò)程。

3 小 結(jié)

比較蛋白質(zhì)組學(xué)是當(dāng)今蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要領(lǐng)域，比較不同生理和病理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)及修飾，對(duì)于揭示生理和病理過(guò)程具有重要意義。iTRAQ技術(shù)作為一種新的、功能強(qiáng)大的比較質(zhì)白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，比較于2D-DIGE、ICAT等傳統(tǒng)技術(shù)，具有高通量、重復(fù)性好、能夠處理復(fù)雜樣本等優(yōu)點(diǎn)，其在真菌研究中的應(yīng)用價(jià)值已得到初步驗(yàn)證，但對(duì)真菌與宿主相互作用過(guò)程中的蛋白質(zhì)組學(xué)變化仍研究較少，因此對(duì)病原真菌與宿主相互作用的研究可能是真菌比較蛋白質(zhì)組學(xué)新的研究方向之一。盡管iTRAQ技術(shù)仍存在一些缺點(diǎn)和不足，但隨著蛋白質(zhì)組學(xué)及生物信息學(xué)等技術(shù)的不斷完善，iTRAQ技術(shù)將會(huì)成為真菌比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)手段，從而為探究真菌致病機(jī)制、尋找新的抗真菌藥物靶標(biāo)等起到推動(dòng)作用。

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