張博，王顯紅，尹時(shí)華

(1.湖北科技學(xué)院五官醫(yī)學(xué)院，湖北咸寧437100;2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

水楊酸鈉對(duì)小鼠耳蝸單離外毛細(xì)胞Prestin分布的影響

張博1，王顯紅1，尹時(shí)華2

(1.湖北科技學(xué)院五官醫(yī)學(xué)院，湖北咸寧437100;2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

目的探討水楊酸鈉對(duì)小鼠聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)閾值和耳蝸外毛細(xì)胞動(dòng)力蛋白(Prestin)分布的影響。方法將28只成年健康小鼠隨機(jī)分為4組:生理鹽水對(duì)照組(A組)、水楊酸鈉4d組(B組)、水楊酸鈉8d組(C組)、水楊酸鈉16d組(D組)。水楊酸鈉200mg/kg·d，經(jīng)腹腔注射，采用美國(guó)TDT系統(tǒng)測(cè)量聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)閾值，熒光顯微鏡下觀察單離外毛細(xì)胞Prestin的分布。結(jié)果①聽(tīng)功能檢測(cè)顯示:與A組比較，B組小鼠ABR閾值升高，但變化尚不顯著(P＞0.05);C組和D組小鼠ABR閾值明顯提高，與A組比較有顯著性差異(P＜0.05);D組小鼠ABR閾值與C組比較有所降低，但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。②熒光顯微鏡下顯示:A組單離外毛細(xì)胞側(cè)膜和底部膜可見(jiàn)明顯的Prestin抗體陽(yáng)性染色，B、C、D組Prestin在外毛細(xì)胞膜上分布不均勻，主要分布在外毛細(xì)胞側(cè)膜。B組底部細(xì)胞膜可見(jiàn)少量陽(yáng)性染色，C、D組底部細(xì)胞膜少量或無(wú)Prestin的陽(yáng)性染色。結(jié)論水楊酸鈉致小鼠聽(tīng)力下降可能與其導(dǎo)致的外毛細(xì)胞底部膜Prestin表達(dá)異常有關(guān)。

水楊酸鈉;耳蝸;外毛細(xì)胞;外毛細(xì)胞動(dòng)力蛋白;小鼠

耳蝸具有頻率選擇和放大效應(yīng)，這一生理特征被認(rèn)為與耳蝸外毛細(xì)胞(outer hair cells，OHC)的電能動(dòng)性有關(guān)。大量的資料證實(shí)［1，2］，OHC的電能動(dòng)性與其側(cè)壁上外毛細(xì)胞動(dòng)力蛋白(Prestin)有緊密聯(lián)系。Prestin又稱為動(dòng)力蛋白(motor protein)，是電運(yùn)動(dòng)和耳蝸放大效應(yīng)的分子基礎(chǔ)。水楊酸鈉是臨床常用的解熱、鎮(zhèn)痛、抗風(fēng)濕藥物，長(zhǎng)時(shí)間或高劑量應(yīng)用容易產(chǎn)生毒副作用，主要表現(xiàn)為可逆的雙耳對(duì)稱性高調(diào)耳鳴和聽(tīng)力下降［3］。關(guān)于水楊酸鈉毒副作用機(jī)制研究很多，但確切機(jī)制尚不完全清楚。耳蝸電生理學(xué)和形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，OHC是水楊酸鈉耳毒性作用的靶細(xì)胞，OHC功能的改變?cè)谒畻钏徕c耳毒性機(jī)理研究中起重要作用［4，5］。近年來(lái)隨著OHC膜Prestin的發(fā)現(xiàn)，水楊酸鈉耳毒性作用與Prestin之間的關(guān)系也成為研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以小鼠為研究對(duì)象，觀察水楊酸鈉對(duì)聽(tīng)性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)閾值和外毛細(xì)胞動(dòng)力蛋白分布的影響，以此探討水楊酸鈉的耳毒性機(jī)制，從而為指導(dǎo)臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與給藥28只經(jīng)檢測(cè)聽(tīng)閾正常的成年健康小鼠(廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，雌雄不限，體重分布在18～25 g。隨機(jī)分為4組，每組7只。生理鹽水對(duì)照組(A組)、水楊酸鈉4d組(B組)、水楊酸鈉8d組(C組)、水楊酸鈉16d組(D組)。B、C、D組均經(jīng)腹腔注射水楊酸鈉200mg/kg·d，分別在4、8、16d進(jìn)行ABR檢測(cè)，A組給等量生理鹽水，水楊酸鈉注射液購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)閾值檢測(cè)各組小鼠用美國(guó)TDT系統(tǒng)進(jìn)行雙側(cè)ABR測(cè)試。小鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉(上海西唐科技公司)按35～40 mg/ kg腹腔注射麻醉，實(shí)驗(yàn)在隔聲屏蔽室內(nèi)進(jìn)行。微型記錄電極放置于兩耳廓前沿連線中點(diǎn)，參考電極置于同側(cè)耳垂，地線接鼻尖。實(shí)驗(yàn)采用短聲(Click)，帶通濾波為300～3000 Hz，疊加次數(shù)為1024次，掃描時(shí)間10ms。起始給聲95 dB SPL，以5 dB SPL或者10 dB SPL依次遞減，以能引出明確的、可重復(fù)的觀察波形的最小刺激強(qiáng)度為聽(tīng)反應(yīng)閾。

1.3 外毛細(xì)胞分離培養(yǎng)及免疫熒光染色ABR閾值檢測(cè)后，各組動(dòng)物迅速斷頭并取出顳骨，打開(kāi)聽(tīng)泡置于PBS溶液中，在解剖顯微鏡下剝?nèi)ノ仛ぃ糜谓z鑷剔除螺旋韌帶和螺旋神經(jīng)節(jié)組織后分離出含Corti器的基底膜，移除Reissner氏膜和Tectorial膜，置于濃度為0.25 mg/ml的木瓜蛋白酶中，37℃孵育10～12min，輕柔吹打后用加有10%胎牛血清的DMEM液終止消化。懸液經(jīng)離心后去上清液，加入1 ml培養(yǎng)液在37℃，5%CO2孵箱孵育24h。經(jīng)24h培養(yǎng)后的外毛細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30min，PBS浸洗5min，3次。封閉液(10%山羊血清和1%BSA)封閉30min，PBS浸洗5min，3次。1∶1 000羊抗Prestin多克隆抗體(Prestin Antibody(C－16):Sc－22694，Santa Cruz) 4℃過(guò)夜，室溫復(fù)溫10min，PBS浸洗5min，3次。1∶64的FITC標(biāo)記的兔抗羊IgG二抗抗體(BA1l10，武漢博士德)在室溫下孵育1h，PBS浸洗5 min，3次。封片后熒光顯微鏡下觀察，陽(yáng)性染色為綠色熒光。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(ˉx±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABR閾值變化與正常對(duì)照組比較，連續(xù)用藥4d，小鼠ABR閾值水平提高，但變化尚不顯著(P＞0.05);8d和16d組小鼠ABR閾值明顯提高，與對(duì)照組或4d組比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);16d組小鼠ABR閾值與8d組比較有所降低，但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠ABR閾值比較(dBSPL，ˉx±s，n=7)

2.2 耳蝸單離外毛細(xì)胞膜Prestin分布熒光顯微鏡觀察熒光顯微鏡下顯示，A組單離0HC側(cè)膜和底部膜可見(jiàn)明顯的Prestin抗體陽(yáng)性染色，Prestin表達(dá)較均一完整。B、C、D組Prestin分布不均勻，主要分布在OHC側(cè)膜。B組底部細(xì)胞膜可見(jiàn)少量陽(yáng)性染色，C、D組底部細(xì)胞膜少量或無(wú)Prestin蛋白的陽(yáng)性染色。

3 討論

人們已經(jīng)知道，能夠?qū)β暡ㄒ鸬亩伝啄ふ駝?dòng)進(jìn)行放大和修飾的外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)，是哺乳動(dòng)物內(nèi)耳聽(tīng)覺(jué)器官高靈敏度和頻率選擇性的基礎(chǔ)。當(dāng)聲音刺激傳入耳蝸引起基底膜振動(dòng)時(shí)使外毛細(xì)胞頂部纖毛發(fā)生偏移，從而開(kāi)放纖毛頂端的機(jī)械換能通道，產(chǎn)生換能電流。外毛細(xì)胞還可由于其膜電位和膜電流的變化導(dǎo)致自身產(chǎn)生收縮與舒張運(yùn)動(dòng)，外毛細(xì)胞具有的這種電－機(jī)械換能特性被稱為電能動(dòng)性，其可對(duì)基底膜的運(yùn)動(dòng)進(jìn)行反饋性調(diào)制，實(shí)現(xiàn)耳蝸放大作用。

大量的資料證實(shí)，OHC的電能動(dòng)性與其側(cè)壁上Prestin有緊密聯(lián)系。Prestin又稱為動(dòng)力蛋白，是外毛細(xì)胞電－機(jī)械活動(dòng)和耳蝸放大作用所必需的蛋白，并特異性地在耳蝸外毛細(xì)胞膜上表達(dá)［6，7］。近年來(lái)有人對(duì)單離外毛細(xì)胞Prestin抗體免疫熒光染色發(fā)現(xiàn):Prestin不僅分布在外毛細(xì)胞側(cè)膜上，而且在基底部側(cè)膜與細(xì)胞底端細(xì)胞膜也存在［8］。Liberman等通過(guò)對(duì)Prestin基因缺失小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠聽(tīng)閾上升且OHC能動(dòng)性喪失，說(shuō)明Prestin基因及其蛋白在外毛細(xì)胞電能動(dòng)性中發(fā)揮著重要作用［9］。

Prestin作為動(dòng)力蛋白具有兩個(gè)基本功能:①電壓感受器功能，可感受外毛細(xì)胞的跨膜電壓改變;②驅(qū)動(dòng)器功能(即電－機(jī)械力的轉(zhuǎn)換器功能)，Prestin通過(guò)本身構(gòu)型變化促使外毛細(xì)胞伸長(zhǎng)和縮短，其可單獨(dú)完成電－機(jī)械轉(zhuǎn)換過(guò)程，不需要額外的能量消耗或細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的參與。細(xì)胞膜電壓的變化，可誘發(fā)其構(gòu)象變化，從而引起外毛細(xì)胞長(zhǎng)度改變。外毛細(xì)胞質(zhì)膜去極化引起胞體縮短，超極化引起胞體伸長(zhǎng)［1，10］。

由于Prestin屬于陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)家族SLC26的成員，因此也顯示出與陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)器相似的一些特征。有人推測(cè)Prestin是一個(gè)被修飾的陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)器，細(xì)胞內(nèi)陰離子(Cl－或HCO3－)對(duì)外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)和Prestin的功能具有重要意義。單價(jià)陰離子尤其是Cl－被證實(shí)為其最有效的刺激因素。Cl－與Prestin結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致Prestin構(gòu)象的改變，引起OHC體壁的伸縮變化，從而產(chǎn)生電能動(dòng)性。在去除細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Cl－后，可使轉(zhuǎn)染Prestin細(xì)胞的電動(dòng)性和非線性電容(門(mén)電流)均消失［11，12］。

水楊酸鈉是一種臨床上廣泛使用的藥物，長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)引起聽(tīng)力下降及耳鳴等臨床癥狀。目前關(guān)于水楊酸鈉毒副作用機(jī)制研究很多，其確切機(jī)制尚不完全清楚。電化學(xué)研究表明［13，14］，水楊酸鈉是Prestin陰離子結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，其與Prestin上陰離子結(jié)合位點(diǎn)的親和力是Cl－的300倍，但結(jié)合后所產(chǎn)生的電－機(jī)械運(yùn)動(dòng)遠(yuǎn)小于Cl－。因此注射大劑量水楊酸鈉使OHC電能動(dòng)性減小，是導(dǎo)致聽(tīng)力損失的可能原因之一。我們實(shí)驗(yàn)中也觀察到:連續(xù)用藥4d后，小鼠即出現(xiàn)ABR閾值升高，聽(tīng)力下降，尤其C組表現(xiàn)得最為明顯，結(jié)果說(shuō)明水楊酸鈉對(duì)聽(tīng)力有損傷作用，另外D組ABR閾值低于C組似乎表明小劑量水楊酸鈉所導(dǎo)致聽(tīng)力下降具有自我恢復(fù)的特點(diǎn)。熒光顯微鏡下顯示:A組OHC膜可見(jiàn)Prestin抗體陽(yáng)性染色，其中包括細(xì)胞側(cè)膜與底端膜，Prestin分布較均一完整;B、C、D組Prestin在外毛細(xì)胞膜上分布不均勻，尤其C、D組OHC底端膜少或無(wú)Prestin蛋白的陽(yáng)性染色。結(jié)果提示:水楊酸鈉致小鼠聽(tīng)力損害與外毛細(xì)胞底部膜Prestin表達(dá)異常存在密切關(guān)聯(lián)。其產(chǎn)生可能原因:①水楊酸鈉是Prestin陰離子結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，能使Cl－與Prestin結(jié)合位點(diǎn)的親和力下降，導(dǎo)致OHC電能動(dòng)性減小。②本實(shí)驗(yàn)注射水楊酸鈉后，外毛細(xì)胞膜Prestin分布發(fā)生變化，尤其底部膜Prestin分布減少或消失。由于外毛細(xì)胞底端為突觸所在部位，底部的突觸實(shí)際上也具有傳入神經(jīng)的成分，有人推測(cè)可能有其傳入性的信號(hào)需要經(jīng)過(guò)外毛細(xì)胞及其突觸結(jié)構(gòu)的處理，其中Prestin可能參與了這些傳入性的信號(hào)處理過(guò)程，Prestin在神經(jīng)遞質(zhì)囊泡釋放過(guò)程中起重要作用［8，15］，外毛細(xì)胞底部膜Prestin分布減少可能影響此作用。組織學(xué)研究也表明，水楊酸鈉可以導(dǎo)致毛細(xì)胞底側(cè)膜系統(tǒng)的膜下池明顯腫脹、空泡形成［4］?？傊甇HC底部膜Prestin分布變化，可能是水楊酸鈉導(dǎo)致聽(tīng)力下降的原因之一，其詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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The Effects of Sodium Salicylate on the Prestin Distribution in Single Outer Hair Cells of Cochlea Mice

ZHANG Bo，WANG Xian－h(huán)ong，YIN Shi－h(huán)ua
(Department of Otorhinolaryngology，Hubei University of Science and Technology，Xianning Hubei 437100，China)

ObjectiveTo investigate the effects of sodium salicylate on the auditory brainstem response (ABR)thresholds and dynein(Prestin)distribution in outer hair cells of cochlea mice.Methods28 healthy adult mice were randomly divided into four groups.Group A:the saline control group;Group B:the sodium salicylate 4 days group;Group C:the sodium salicylate 8 days group;Group D:the sodium salicylate 16 days group.Sodium salicylate was injected by intraperitoneal injection(200mg/kg·d).Auditory brainstem response thresholds were detected by the United States TDT system.The distribution of prestin was examined by fluorescence microscopy.Results①Auditory function tests showed:the ABR thresholds of group B increased，but the change is not significant when compared with group A(P＞0.05);ABR thresholds of Group C and D were significantly levated，there was a significant difference(P＜0.05)when compared with group A;there was no significant difference between group C and group D(P＞0.05).②fluorescence microscope showed:Group A，the membrane side and bottom of single outer hair cell can be seen clearly prestin antibody staining.B、C、D group，prestin uneven distributed in the outer hair cell membrane，mainly distributed in the side membrane of outer hair cells.Group B，the bottom membrane showed small amount staining.C、D group，the membrane bottom of outer hair cell showed little or no prestin positive staining.ConclusionSodium salicylate induced mice hearing loss may be correlated with prestin abnormal expression in bottom membrane of outer hair cells.

Sodium salicylate;Cochlea;Outer hair cells;Prestin;Mice

R965

A

2095－4646(2015)01－0006－04

2014－10－11)