江雨 周裕林

（廈門市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，福建廈門 361003）

我國(guó)假肥大肌營(yíng)養(yǎng)不良征防控的技術(shù)路徑與優(yōu)生策略選擇

江雨 周裕林*

（廈門市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，福建廈門 361003）

l 背景介紹

假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良征（Duchenne and Becker muscular dystrophy，DMD／BMD）是全球最常見的X-連鎖隱性致死性基因疾病之一，男嬰發(fā)生率約為1／3500［1］。臨床上根據(jù)發(fā)病年齡及病程差異，將患者分為杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）和貝氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（Becker muscular dystrophy，BMD），兩者都是由于編碼抗肌萎縮蛋白（dystrophin）的DMD基因存在缺陷而致病的。該基因定位于性染色體Xp21.2區(qū)域，是人類目前已知的最大基因，長(zhǎng)度約為2.4Mb，包含79個(gè)外顯子?；颊呋蛉毕莸闹饕愋桶ㄍ怙@子缺失、重復(fù)及基因微小突變。

自被定義以來(lái)的近一個(gè)半世紀(jì)，DMD至今仍無(wú)治愈方法，患者生存質(zhì)量普遍不佳［2］。因此，針對(duì)疾病遺傳機(jī)制及防控手段的研究一直是這一領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。Konda及Tsubaki［3］于1973年首次報(bào)道了對(duì)DMD高危孕婦實(shí)施產(chǎn)前診斷。自此之后，伴隨臨床取材與診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步，包括胎兒性別鑒定、胎兒肌肉活檢術(shù)、臍帶血肌酸磷酸激酶檢測(cè)、熒光原位雜交［4］及各類分子診斷技術(shù)先后被用于DMD的產(chǎn)前診斷中。對(duì)具有家族史的高危孕婦實(shí)施遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷，避免新生患兒出生成為現(xiàn)今全球DMD防控的基本策略。而隨著分子診斷技術(shù)的日趨成熟，基因檢測(cè)已成為當(dāng)前DMD疾病診斷及產(chǎn)前診斷的重要手段。

先天缺陷的防治是世界衛(wèi)生組織考量一國(guó)或一地區(qū)社會(huì)發(fā)展水平的重要指標(biāo)，目前全球不少發(fā)達(dá)國(guó)家及地區(qū)將控制先天性缺陷作為社會(huì)發(fā)展整體戰(zhàn)略規(guī)劃之一。但總體而言，世界各國(guó)及各地區(qū)在這一領(lǐng)域的發(fā)展水平極不均衡，尤其在發(fā)展中國(guó)家，受限于醫(yī)療資源短缺等因素，包括DMD在內(nèi)的眾多先天缺陷防控形式不容樂觀。作為全球最大的發(fā)展中國(guó)家，由于在疾病宣傳、保健、教育、預(yù)防等方面長(zhǎng)期滯后，中國(guó)在DMD患者的確診率、患者生存周期、家族成員接受遺傳優(yōu)生服務(wù)比率等諸多方面與發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)存在著較大差距。據(jù)估算，全國(guó)DMD患者累積數(shù)量至今已超過10萬(wàn)，且每年新出生患兒多達(dá)數(shù)千。本文之目的在于試圖分析導(dǎo)致這一現(xiàn)狀的根源，同時(shí)結(jié)合作者所在醫(yī)院的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，嘗試提出適應(yīng)我國(guó)國(guó)情的DMD分子診斷技術(shù)路徑及遺傳優(yōu)生策略，以期為我國(guó)DMD防控工作的推進(jìn)提供借鑒。

2 國(guó)內(nèi)DMD防控基礎(chǔ)薄弱因素

從20世紀(jì)70年代起，國(guó)內(nèi)陸續(xù)有學(xué)者開始關(guān)注于DMD的相關(guān)研究，此后在一些大中城市的高等級(jí)綜合醫(yī)院或婦幼保健院開展了DMD臨床診斷或產(chǎn)前診斷服務(wù)。時(shí)至今日，雖歷經(jīng)40余年的探索與發(fā)展，且取得了一些成效，但相較于龐大的患者人群，我國(guó)在DMD的遺傳咨詢及優(yōu)生服務(wù)供應(yīng)能力上仍顯得十分薄弱?，F(xiàn)實(shí)中，患者往往需要輾轉(zhuǎn)數(shù)家醫(yī)院尋求確診。以作者單位所在的福建省為例，人口數(shù)量約4000萬(wàn)的全省僅有兩家醫(yī)療機(jī)構(gòu)具備DMD產(chǎn)前診斷能力。按照?qǐng)?bào)道的發(fā)生率估算，該省每年新出生的DMD患兒數(shù)約在50例左右，患者總數(shù)應(yīng)已累計(jì)達(dá)數(shù)千例。而實(shí)際上，作者所在醫(yī)院自2007年開展DMD臨床基因檢測(cè)以來(lái)，至今僅確診32個(gè)DMD病例家系（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。因而有理由推斷，該省仍有為數(shù)眾多的患者可能由于各種原因而未能獲得及時(shí)準(zhǔn)確的診斷。作為經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展相對(duì)發(fā)達(dá)的沿海省份尚且如此，全國(guó)面臨的總體現(xiàn)狀可見一斑。事實(shí)上，我國(guó)至今未出臺(tái)罕見疾病的官方定義，未制定任何正式的遺傳咨詢相關(guān)政策及指導(dǎo)性文件，相關(guān)政策法規(guī)的欠缺和不完善是導(dǎo)致我國(guó)在類似DMD等罕見疾病防控基礎(chǔ)薄弱的根本原因。而政策法規(guī)的不完善進(jìn)而導(dǎo)致一系列與此相關(guān)的各環(huán)節(jié)進(jìn)展緩慢。這其中，以下兩個(gè)問題顯得尤為突出：首先，人才儲(chǔ)備的不足已成為制約我國(guó)遺傳病防控的首要原因，目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)醫(yī)學(xué)院校未開設(shè)專門的醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)專業(yè)，同時(shí)也無(wú)專門的機(jī)構(gòu)進(jìn)行遺傳咨詢師的認(rèn)證與考核，致使全國(guó)至今幾無(wú)醫(yī)院設(shè)置專門的遺傳咨詢門診，絕大多數(shù)先天缺陷或遺傳病患者只能根據(jù)其臨床表征尋求對(duì)癥科室的診療，而由于并未受過系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)訓(xùn)練，多數(shù)臨床醫(yī)師對(duì)此類疾病的癥狀及發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)模糊，誤診、漏診現(xiàn)象十分常見［5，6］；其次，我國(guó)目前實(shí)施的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與產(chǎn)前診斷的的準(zhǔn)入機(jī)制事實(shí)上也已成為罕見病防控的另一阻礙因素，21世紀(jì)以來(lái)，臨床分子診斷水平極速發(fā)展，包括DMD在內(nèi)的不少先天疾病的臨床診斷技術(shù)已趨于成熟，然而因未能符合我國(guó)當(dāng)前實(shí)施的臨床技術(shù)準(zhǔn)入制度，以致大多數(shù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)，尤其是公立醫(yī)院，即便已然具備技術(shù)儲(chǔ)備，卻因顧及法律及政策風(fēng)險(xiǎn)而不愿貿(mào)然開展，拒診病患的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。

依上可見，相關(guān)行政部門應(yīng)盡快制訂先天缺陷、基因疾病的臨床應(yīng)用服務(wù)規(guī)范，扭轉(zhuǎn)長(zhǎng)期以來(lái)重治療、輕預(yù)防的固有思維模式，同時(shí)加大罕見病的宣傳、教育和投入，才能從根本上為患者及醫(yī)務(wù)人員提供保障。

3 DMD分子診斷技術(shù)選擇

除政策法律因素外，DMD遺傳異質(zhì)性及診斷技術(shù)的多樣性，客觀上也對(duì)準(zhǔn)備開展此類服務(wù)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)提出了較高的技術(shù)和管理要求。目前，臨床上常用的DMD的診斷方法包括血液生化檢測(cè)、肌電圖分析、肌肉活檢及分子診斷等。由于缺少權(quán)威的技術(shù)指導(dǎo)，國(guó)內(nèi)部分已開展DMD臨床診斷服務(wù)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)往往根據(jù)自身?xiàng)l件選擇一類或幾類技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)，并未形成統(tǒng)一的實(shí)施規(guī)范。其中，即便是如今已被普遍公認(rèn)為疾病確診主要依據(jù)的分子診斷技術(shù)，各自的選擇也往往并不一致，客觀上造成了不同診斷機(jī)構(gòu)在疾病確診率上的差異。目前常見的DMD分子診斷方法主要包括多重 PCR（multiplex- PCR，m PCR）、多重連接探針擴(kuò)增（multiplex ligation-dependent probe amplification，ML PA），變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography，DH PLC）、Sanger測(cè)序及用以連鎖分析的短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）技術(shù)。診斷機(jī)構(gòu)在選擇技術(shù)的過程中，需了解每一類技術(shù)在DMD診斷中存在各自的優(yōu)勢(shì)及缺陷，見表1。

3.1 多重 PCR 據(jù)統(tǒng)計(jì)，約50%～65%的DMD／BMD患者為DMD基因外顯子缺失所致，因而對(duì)此類基因型的排查往往成為臨床DMD分子診斷的優(yōu)先考量。由于無(wú)需復(fù)雜的大型儀器設(shè)備，且具備操作簡(jiǎn)易、成本低的優(yōu)勢(shì)，多重 PCR成為國(guó)內(nèi)部分開展DMD臨床分子診斷醫(yī)院的選擇［7-9］。相較于優(yōu)勢(shì)，該方法的缺點(diǎn)亦較突出，一是檢測(cè)范圍無(wú)法覆蓋DMD基因所有外顯子；二是無(wú)法檢出女性攜帶者。此外，凝膠電泳過程也較易導(dǎo)致 PCR產(chǎn)物的污染，并進(jìn)而影響到后續(xù)診斷的可靠性。

3.2 連鎖分析 連鎖分析的原理是通過親代與先證者基因標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性，建立突變基因與標(biāo)記等位基因的連鎖相，從而對(duì)其他親屬或下一次妊娠胎兒的基因型進(jìn)行判斷。DMD連鎖遺傳分析一般選擇DMD基因兩端及內(nèi)含子區(qū)短串聯(lián)重復(fù)序列［10］。其主要優(yōu)點(diǎn)在于當(dāng)無(wú)法通過其他技術(shù)獲得先證者基因型時(shí)，可通過連鎖相得到的基因單體型信息判斷后代的疾病再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。但需要注意的是，在某些情況下，使用該技術(shù)可能出現(xiàn)因多態(tài)信息量不足而無(wú)法分析的情況。此外，如果基因在減數(shù)分裂中發(fā)生了重組，或先證者為單純散發(fā)病例，若仍依據(jù)原先的連鎖相確定受檢者的基因型，就有誤診的可能性。因此在臨床實(shí)踐中，為提高診斷的可靠性，連鎖分析一般需與其他分子診斷技術(shù)聯(lián)合使用［11］。3.3 ML PA 該技術(shù)是2002年由Schouten等［12］開發(fā)的一種中通量基因拷貝數(shù)分析方法。作為目前唯一的商品化DMD基因檢測(cè)方案，該技術(shù)可在2個(gè) PCR反應(yīng)內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)DMD基因所有外顯子的拷貝數(shù)信息分析。ML PA對(duì)由外顯子拷貝數(shù)異常導(dǎo)致的患者及攜帶者均具有較佳的檢測(cè)靈敏度。另外，對(duì)處于探針雜交或連接位點(diǎn)的微小基因突變，該技術(shù)也具有一定的檢出能力。隨著毛細(xì)管電泳設(shè)備的日益普及，ML PA事實(shí)上已成為當(dāng)前全球DMD臨床診斷的首選方案［13，14］，在國(guó)內(nèi)已開展DMD基因診斷的醫(yī)療機(jī)構(gòu)中，亦多為采用。但需注意的是，對(duì)于因基因微小突變所致的病患，多數(shù)情況下ML- PA無(wú)法檢出。此外，對(duì)于經(jīng)ML PA診斷為單外顯子缺失型病例，需通過其他方法進(jìn)一步區(qū)分屬于外顯子部分序列的缺失，還是因探針雜交或連接位點(diǎn)的突變所致［15］。

表l DMD基因診斷技術(shù)比較

3.4 DH PLC 變性高效液相色譜是一類在單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SN P）研究中常見的分析技術(shù)。盡管同時(shí)具有基因拷貝數(shù)分析功能，但受限于檢出能力［16］，在DMD診斷中，該技術(shù)主要被用于基因微小突變篩查［17-19］。由于并非對(duì)核酸序列的直接測(cè)定，故經(jīng)DH PLC檢測(cè)提示陽(yáng)性結(jié)果者，需進(jìn)一步經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。因此總體而言，盡管DH PLC的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)成本相對(duì)較低，然而由于局限較多、穩(wěn)定性易受干擾，因而多用于學(xué)術(shù)研究而鮮見于臨床診斷。

3.5 Sanger測(cè)序 同DH PLC類似，Sanger測(cè)序在DMD遺傳分析中主要針對(duì)于基因的微小變異［20］。其相較于前者的優(yōu)勢(shì)在于，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的病理性突變可直接作為基因診斷的結(jié)論。其缺點(diǎn)是成本較高、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)雜，此外如果實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的覆蓋范圍僅限外顯子區(qū)域，則由內(nèi)含子突變導(dǎo)致的DMD無(wú)法檢出。

3.6 高通量測(cè)序（high-throughput sequencing，H TS） 由于DMD基因變異類型的多樣性，上述幾類技術(shù)在DMD的診斷中不同程度的存在檢出能力不足的問題。有鑒于此，臨床上亟需一種可覆蓋所有DMD突變類型的檢測(cè)技術(shù)，而隨著高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)和成熟為這一問題的解決提供了可能。近年來(lái)，已有學(xué)者嘗試將高通量測(cè)序應(yīng)用于DMD的疾病診斷［21-23］，并取得了良好的效果。缺點(diǎn)是現(xiàn)階段仍受技術(shù)準(zhǔn)入及成本等制約，預(yù)計(jì)在國(guó)內(nèi)的大規(guī)模臨床應(yīng)用尚需時(shí)日。

4 DMD臨床咨詢、診斷及遺傳優(yōu)生策略

遺傳咨詢的主要目標(biāo)有兩點(diǎn)，一是判斷疾病是否屬于遺傳，二是評(píng)估疾病在患者家系后代的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。相較于我國(guó)南方較為常見的地中海貧血等遺傳疾病，除患者的基因變異類型存在多樣性外，人群中DMD的發(fā)生方式也具有異質(zhì)性?；颊呋蛲蛔兛赡茉从谟H代伴性遺傳、親代生殖腺嵌合，或是單純散發(fā)。DMD突變類型及遺傳方式的這些特點(diǎn)對(duì)臨床遺傳咨詢及診斷策略的選擇提出了一定的挑戰(zhàn)。然而由于國(guó)內(nèi)長(zhǎng)期無(wú)相關(guān)臨床操作規(guī)范可供醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)施借鑒，導(dǎo)致不少誤診、漏診的情況發(fā)生。有鑒于此，作者所在單位參照歐洲多個(gè)國(guó)家聯(lián)合發(fā)布的DMD產(chǎn)前診斷實(shí)踐指南［24］，同時(shí)結(jié)合自身臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，提出如下操作建議。

4.1 知情同意原則 臨床實(shí)施DMD基因診斷的一個(gè)重要前提是須向就診者說明所采用技術(shù)的局限性。由于ML PA檢出范圍僅限于基因的大片段缺失、重復(fù)及少數(shù)微小突變，因此有部分患者或其親屬可能無(wú)法通過該技術(shù)發(fā)現(xiàn)致病基因變異，而對(duì)擬接受高通量測(cè)序等技術(shù)進(jìn)一步排查者，亦需說明存在不能檢出致病突變的可能性。（圖1）

4.2 先證者／攜帶者基因檢測(cè)策略 綜合疾病檢出率及檢測(cè)成本等因素考量，具備條件的醫(yī)院機(jī)構(gòu)現(xiàn)階段應(yīng)考慮以ML PA為一線DMD基因篩查技術(shù)。需要注意的是，對(duì)于ML PA提示為單外子缺失的結(jié)果，需進(jìn)一步驗(yàn)證；對(duì)臨床高度懷疑為患者或攜帶者，如ML PA檢測(cè)為陰性，可建議其進(jìn)一步行高通量測(cè)序檢測(cè)（圖1）。

圖l DMD基因診斷流程圖

4.3 DMD產(chǎn)前診斷策略 針對(duì)預(yù)行產(chǎn)前診斷者，應(yīng)同時(shí)獲知先證者及其本人基因型，對(duì)于因先證者病逝等原因無(wú)法獲取樣本、并無(wú)法獲知先證者基因型信息的情況下，如受檢者為體細(xì)胞DMD攜帶者，則建議實(shí)施產(chǎn)前診斷；如在可供選擇的檢測(cè)范圍內(nèi)未檢出體細(xì)胞攜帶致病突變，則應(yīng)向其說明后代再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，尤其是針對(duì)曾經(jīng)生育基因突變明確患兒的高風(fēng)險(xiǎn)女性，需告之存在生殖腺嵌合的可能，并由其本人知情選擇是否實(shí)施產(chǎn)前診斷（圖2）。

5 DMD遺傳優(yōu)生發(fā)展趨勢(shì)

圖2 DMD產(chǎn)前診斷實(shí)施流程圖

盡管侵入性的產(chǎn)前診斷方式已十分成熟，但現(xiàn)實(shí)中，仍有部分母體或胎兒在取樣過程或鑒定為患癥胎兒后實(shí)施的引產(chǎn)術(shù)中發(fā)生損害。因而，如何在優(yōu)生過程中盡可能減少對(duì)母胎的影響是近階段胎兒醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)之一。這其中，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷及植入前診斷是這一領(lǐng)域中有望獲得突破的兩個(gè)領(lǐng)域。

5.1 無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷 所謂無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷，是指采用抽取孕婦外周血等非侵入性方式獲取胎兒的遺傳物質(zhì)、并對(duì)其進(jìn)行遺傳分析的技術(shù)手段。根據(jù)獲得的胎兒遺傳物質(zhì)的類型，從孕婦循環(huán)血液中可供分離的胎兒遺傳物質(zhì)包括胎兒有核紅細(xì)胞（nucleated red blood cells，NRBCs）及胎兒游離DNA片段這兩類。兩者之中，由于胎兒有核紅細(xì)胞中包含有完整的胎兒遺傳信息，因而在高通量測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)之前是無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷研究的重要方向［25］。然而時(shí)至今日，胎兒有核紅細(xì)胞的富集技術(shù)一直未獲得實(shí)質(zhì)性的突破，故短期間該技術(shù)難以被應(yīng)用于臨床。與此同時(shí)，高通量測(cè)序技術(shù)在近十年來(lái)取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展，并且在檢測(cè)成本上已趨近于患者可接受的水平。近年來(lái)，應(yīng)用高通量測(cè)序?qū)μビ坞xDNA的分析已成為DMD無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)研究領(lǐng)域的新動(dòng)向［26］。事實(shí)上，針對(duì)部分染色體非整倍體異常的高通量測(cè)序無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查項(xiàng)目，近年已在國(guó)內(nèi)獲得了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用，預(yù)計(jì)在不遠(yuǎn)的將來(lái)，該技術(shù)也有望在DMD的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)中實(shí)現(xiàn)突破。

5.2 植入前診斷 無(wú)論是侵入性還是無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷，對(duì)胎兒基因型的確診仍需在胚胎發(fā)育到一定階段之后。如經(jīng)診斷發(fā)現(xiàn)胎兒基因存在缺陷，孕婦需面臨因終止妊娠而產(chǎn)生的身體及心理的雙重傷害。因此，對(duì)孕產(chǎn)婦及其家屬而言，如何避免胎兒攜帶缺陷基因更具有現(xiàn)實(shí)意義。植入前診斷是有望解決這一現(xiàn)實(shí)問題的最佳手段，目前已有一些機(jī)構(gòu)已經(jīng)開始嘗試DMD的植入前診斷研究并取得功［27］，隨著成果的不斷深入，相信這一領(lǐng)域的成果也終將為DMD的防控帶來(lái)根本性的解決之道。

［1］Flanigan K.Duchenne and Becker muscular dystrophies［J］.Neurol Clin，2014，32：671-688，viii.

［2］胡君，蔣莉，袁召建，等.假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良的診治與生存質(zhì)量分析［J］.中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志，2012，38：587-592.

［3］Kondo K，Tsubaki T.Abortion programme in Duchenne muscular dystrophy in Japan［J］.Lancet，1973，1：543.

［4］Rosenberg C，Navajas L，Vagenas DF，et al.Clinical diagnosis of heterozygous dystrophin gene deletions by fluorescence in situ hybridization［J］.NMD，1998，8：447-452.

［5］劉平，吳懼，胡文廣，等.兒童進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良誤診為病毒性肝炎五例臨床分析［J］.臨床誤診誤治，2012，25：40-42.

［6］張慧娟.Duchenne型進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良誤診為心肌損害1例分析［J］.中國(guó)誤診學(xué)雜志，2009，9：6933-6933.

［7］王皖駿，朱海燕，朱瑞芳，等.假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥家系的基因檢測(cè)與產(chǎn)前診斷［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2013，30：45-48.

［8］洪志丹，張?jiān)?，王燕，?應(yīng)用三聯(lián) PCR技術(shù)產(chǎn)前診斷假性肥大型進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良的研究［J／CD］.中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2012，6：6766-6771.

［9］賀靜，朱寶生，唐新華，等.假肥大型進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良120例疑診患者的基因診斷［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2011，26：566-568.

［10］趙慧茹，王莉，廖世秀.3例無(wú)家族史Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良患者的基因突變研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2013，42：6-7，12.

［11］杜娟，許涓涓，韋波，等.聯(lián)合應(yīng)用ML PA及連鎖分析對(duì)廣西地區(qū)Duchenne型假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥產(chǎn)前診斷分析［J］.右江醫(yī)學(xué)，2014，42：145-148.

［12］Schouten J P，Mc Elgunn CJ，Waaijer R，et al.Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification［J］.Nucleic acids research，2002，30：e57.

［13］Zimowski J，Massalska D，Holding M，et al.ML PA based detection of mutations in the dystrophin gene of 180 Polish families with Duchenne／Becker muscular dystrophy［J］.Neurol Neurochir Pol，2014，48：416-422.

［14］Uwineza A，Hitayezu J，Murorunkwere S，et al.Genetic diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophy using multiplex ligation-dependent probe amplification in Rwandan patients［J］.J Trop Pediatr，2014；60：112-117.

［15］黎青，李少英，何文智，等.對(duì)用多重連接探針擴(kuò)增檢出的假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥基因單個(gè)外顯子缺失的鑒別診斷［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014；37：207-209.

［16］申本昌，張成，孫筱放，等.多重連接依賴式探針擴(kuò)增和變性高效液相色譜法檢測(cè)Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥患者DMD基因的缺失／重復(fù)突變［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，29：83-86.

［17］Bennett RR，den Dunnen J，O＇Brien KF，et al.Detection of mutations in the dystrophin gene via automated DH PLC screening and direct sequencing［J］.BMC genetics，2001，2：17.

［18］Muscarella LA， Piemontese MR，Barbano R，et al.Novel mutations of dystrophin gene in DMD patients detected by rapid scanning in biplex exons DH PLC analysis［J］.Biomolecular engineering，2007，24：231-236.

［19］陳亞男，周鑫，金春蓮，等.應(yīng)用DH PLC技術(shù)檢測(cè)非缺失型DMD致病基因的新突變［J］.中華兒科雜志，2007；45：413-416.

［20］高志杰，姜茜，陳倩，等.假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良一個(gè)核心家系DMD基因分析［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2014；43：139-142.

［21］戴毅，姚鳳霞，魏曉明，等.基因芯片捕獲及高通量測(cè)序在迪謝內(nèi)型肌營(yíng)養(yǎng)不良基因診斷中的初步研究［J］.中華神經(jīng)科雜志，2013；46：188-192.

［22］劉敏娟，謝敏，毛君，等.第二代測(cè)序技術(shù)在假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良基因診斷中的應(yīng)用［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2012；29：249-254.

［23］Liu MJ，Xie M，Mao J，et al.Application of next-generation sequencing technology for genetic diagnosis of Duchenne muscular dystrophy［J］.Chinese journal of medical genetics，2012，29：249-254.

［24］Abbs S，Tuffery-Giraud S，Bakker E，et al.Best Practice Guidelines on molecular diagnostics in Duchenne／Becker muscular dystrophies［J］.Neuromuscular Disorders，2010，20：422-427.

［25］Wang M，Jin C，Lin C，et al.Non-invasive prenatal diagnosis of Duchenne muscular dystrophy［J］.Chinese journal of medical genetics，2001，18：139-142.

［26］Wu D，Hou Q，Li T，et al.The use of cffDNA in fetal sex determination during the first trimester of pregnancy of female DMD carriers［J］.Intractable Rare Dis Res，2012，1：157-160.

［27］Ye Y，Yu P，Yong J，et al. Preimplantational Genetic Diagnosis and Mutation Detection in a Family with Duplication Mutation of DMD Gene［J］.Gynecologic and obstetric investigation，2014，78：272-278.

R746.4

A

2015-02-06）

編輯：宋文穎

10.13470／j.cnki.cjpd.2015.02.017

*通訊作者：周裕林，E-mail：yulin＿zhou＠126.com