陳蓉，陳偉，吳啟南（1.蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 蘇州 15104；.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 15009；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 10046）

芡實(shí)為睡蓮科植物芡Euryale ferox Salisb的干燥成熟種仁[1]。營養(yǎng)成分以淀粉為主，另富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖等。芡實(shí)中總氨基酸平均值為103.33mg/g，游離氨基酸為0.98mg/g，人體必需氨基酸種類齊全，且比例均衡，接近世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國糧農(nóng)組織（WHO/FAO）標(biāo)準(zhǔn)模式[2]。芡實(shí)蛋白富含多種必需氨基酸，是一種結(jié)構(gòu)比較平衡的優(yōu)質(zhì)膳食蛋白[3]。芡實(shí)水溶性部位能通過上調(diào)細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白-3（SOCS-3）、下調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）及轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）在腎組織的表達(dá)水平來延緩糖尿病腎病的進(jìn)展[4-5]。水溶性蛋白質(zhì)是芡實(shí)蛋白質(zhì)中可以溶解于水的部分，可以被人體直接吸收利用。蛋白質(zhì)含量測定最常見的方法包括凱氏法、福林酚法和考馬斯亮藍(lán)法等。本試驗(yàn)采用考馬斯亮藍(lán)法測定不同產(chǎn)地芡實(shí)水溶性蛋白質(zhì)含量，并進(jìn)行聚類分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 儀器

BT 125D型十萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；UV2000紫外可見分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器股份有限公司）；PE Lambda 35型紫外分光光度計(jì)（美國PerkinElmer公司）；WH-1型微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；FSH-2A型可調(diào)高速勻漿機(jī)（金壇市金南儀器廠）；Universal-32R型高速冷凍離心機(jī)（德國Hettich公司）。

1.2 試劑

牛血清白蛋白（上?；菖d生化試劑有限公司，批號:2012062525）；考馬斯亮藍(lán)G-250（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號:20120817）；磷酸為優(yōu)級純，95%乙醇為分析純，試驗(yàn)用水均為雙重蒸餾水。

1.3 藥材

芡實(shí)樣品來源于全國14個產(chǎn)地，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院吳啟南教授鑒定為睡蓮科植物芡E.ferox Salisb的干燥成熟種仁。芡實(shí)樣品來源詳見表1。

表1 芡實(shí)樣品來源Tab 1 Sources of E.ferox

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel、ORIGIN 7.5和SPSS 18.0軟件對15個產(chǎn)地的芡實(shí)藥材水溶性蛋白質(zhì)含量進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分析。

2 方法與結(jié)果

2.1 考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑的配制[6]

精密稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50ml 95%乙醇，再加入100ml 85%磷酸，用雙重蒸餾水稀釋至1000ml。此溶液可在常溫下放置1個月。

2.2 對照品溶液的配制

精密稱取牛血清白蛋白50.10mg，加雙重蒸餾水溶解并定容至10ml量瓶中；再精密吸取1ml至10ml量瓶中，加雙重蒸餾水定容，配成濃度為0.5010mg/ml的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

稱取干燥的芡實(shí)藥材樣品1 g，加3ml雙重蒸餾水研磨成勻漿，于4℃條件下，浸泡48 h[7]，又在4℃條件下，以半徑為3 cm、11000 r/min離心18min，上清液為蛋白質(zhì)粗提液，即得。

2.4 吸收波長的確定

精密量取“2.2”項(xiàng)下對照品溶液0.3ml和“2.3”項(xiàng)下供試品溶液0.8ml，分別置具塞試管中，用去離子水補(bǔ)充至1ml。各試管中分別加入“2.1”項(xiàng)下考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑5.0ml，立即在漩渦混合器上混合，以相應(yīng)的試劑為空白，于400～900nm處掃描，確定測定波長為595nm。全波長掃描圖詳見圖1。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

圖1 蛋白質(zhì)全波長掃描圖Fig 1 Full wavelength scan map of proteins

精密吸取牛血清白蛋白對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.5010mg/ml）0.00、0.01、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30ml，用去離子水補(bǔ)充至1ml。分別加入“2.1”項(xiàng)下考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑5.0ml，立即在漩渦混合器上混合；靜置5min后，用分光光度計(jì)測定各溶液在595nm處的吸光度值。以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度（x，mg/ml）為橫坐標(biāo)、吸光度值（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝4.0184x－0.0098（r＝0.9992）。結(jié)果，牛血清白蛋白質(zhì)量濃度在0.00501～0.1503mg/ml范圍內(nèi)與其吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取牛血清白蛋白對照品溶液（質(zhì)量濃度為 0.5010mg/ml）0.20ml，用去離子水補(bǔ)充至 1ml，按“2.5”項(xiàng)下方法操作，重復(fù)6次，分別測定吸光度值。結(jié)果，RSD為0.19%，表明儀器精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取芡實(shí)樣品（S9）1 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液及再按“2.5”項(xiàng)下操作，分別在配制0、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60min測定吸光度值。結(jié)果，RSD為1.08%，表明供試品溶液在60min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取芡實(shí)樣品（S9）6份，各1 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5”項(xiàng)下操作分別測定吸光度值。結(jié)果，平均含量為0.4732mg/g，RSD為2.04%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.6.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取芡實(shí)樣品（S9）6份，各0.5 g，分別加入質(zhì)量濃度為0.5010mg/ml的牛血清白蛋白對照品溶液0.5ml，即含對照品0.2505mg，分別按“2.3”和“2.5”項(xiàng)下方法操作，測定吸光度值，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果詳見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Average recovery test of sample（n＝6）

2.7 含量測定

準(zhǔn)確稱取樣品（S1～S15）各1 g，按“2.3”項(xiàng)下操作制備供試品溶液，精密吸取各芡實(shí)供試品溶液（S1～S15）0.8ml，0號加蒸餾水1ml作為空白對照，分別加入考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑5.0ml，在旋渦混合器上充分混合，在分光光度計(jì)上測定各樣品在595nm處的吸光度值，平行測定3次。根據(jù)測出的吸光度值，計(jì)算樣品中的蛋白質(zhì)含量，結(jié)果詳見表3。

由表3可知，各產(chǎn)地芡實(shí)水溶性蛋白質(zhì)含量差異較大，平均值為0.4577mg/g。其中，S10江蘇蘇州的水溶性蛋白質(zhì)含量最高，S15的含量最低。與筆者前期研究的芡實(shí)中氨基酸含量[2]相比，芡實(shí)中水溶性蛋白質(zhì)含量很低，僅為萬分之幾，與游離氨基酸含量接近，而總氨基酸則達(dá)到了百分之十左右。其原因可能是總氨基酸來源于全部酸水解的蛋白質(zhì)和肽類化合物，而本試驗(yàn)考慮到蛋白質(zhì)受熱變性，采用冰浴研磨，提取的基本為活性蛋白質(zhì)，處理方法較為簡便，且保證了提取物的準(zhǔn)確性。

表3 芡實(shí)水溶性蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果Tab 3 Results of content determination of water-soluble proteins in E.ferox

2.8 不同產(chǎn)地芡實(shí)水溶性蛋白質(zhì)聚類分析

運(yùn)用SPSS 18.0軟件中的hierarchical cluster analysis對15個產(chǎn)地的芡實(shí)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類，方法為組間平均，公式為平方歐式距離，得到不同樣品的聚類分析圖。15個產(chǎn)地芡實(shí)被聚為6類，詳見圖2。

圖2 不同產(chǎn)地芡實(shí)水溶性蛋白質(zhì)聚類結(jié)果Fig 2 Clustering results of water-soluble protein in E.ferox

第Ⅰ類包括3個產(chǎn)地（S8、S10、S12），分別為湖南益陽、江蘇蘇州、江蘇金湖，這一類產(chǎn)地水溶性蛋白質(zhì)含量最高，均超過0.6mg/g，其中江蘇蘇州的含量最高，達(dá)到0.6966mg/g。第Ⅱ類包括4個產(chǎn)地（S1、S3、S13、S14），分別為四川成都、安徽蕪湖、江蘇建湖、江蘇浦口，這一類產(chǎn)地水溶性蛋白質(zhì)含量次之，均超過0.5mg/g，其中江蘇浦口的含量最高，達(dá)到0.5457mg/g。第Ⅲ類包括3個產(chǎn)地（S6、S9、S11），分別為福建莆田、廣東肇慶、江蘇寶應(yīng)，這一類產(chǎn)地水溶性蛋白質(zhì)含量位列第3位，均超過0.4mg/g，其中廣東肇慶的含量最高，達(dá)到0.4746mg/g。第Ⅳ類包括2個產(chǎn)地（S5、S7），分別為江西武穴、四川中江，這一類產(chǎn)地水溶性蛋白質(zhì)含量位列第4位，均超過0.3mg/g，其中四川中江的含量最高，達(dá)到0.3891mg/g。第Ⅴ類包括2個產(chǎn)地（S2、S4），分別為山東菏澤、河北安國，這一類產(chǎn)地水溶性蛋白質(zhì)含量位列第5位，均超過0.2mg/g，其中河北安國的含量最高，達(dá)到0.2557mg/g。第Ⅵ類包括1個產(chǎn)地（S15），為對照藥材，其水溶性蛋白質(zhì)含量最低，僅為0.1220mg/g?？赡芘c其存放時間太久導(dǎo)致水溶性蛋白質(zhì)減少有關(guān)。

綜上所述，聚類分析結(jié)果可以認(rèn)為芡實(shí)水溶性蛋白質(zhì)含量有明顯的產(chǎn)地差異，基本以長江流域的芡實(shí)水溶性蛋白質(zhì)含量較高，南方芡實(shí)次之，而北方芡實(shí)的水溶性蛋白質(zhì)含量最少，可能與氣候、水環(huán)境以及種質(zhì)差異有關(guān)。故產(chǎn)地從一定程度上可以解釋芡實(shí)水溶性蛋白質(zhì)的變異，同時結(jié)合氨基酸分析評價[2]，來判斷其營養(yǎng)價值的高低。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，各產(chǎn)地芡實(shí)水溶性蛋白質(zhì)含量均較低，平均值為0.4577mg/g。蛋白質(zhì)在0.00501～0.1503mg/ml范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系，復(fù)合物形成后的60min內(nèi)測定穩(wěn)定性較好。聚類分析結(jié)果顯示，芡實(shí)水溶性蛋白質(zhì)含量有明顯的產(chǎn)地差異，長江流域含量較高，南方芡實(shí)次之，而北方芡實(shí)的水溶性蛋白質(zhì)含量最少。

考馬斯亮藍(lán)法是Bradford于1976年建立起來的測定蛋白質(zhì)含量的方法，蛋白質(zhì)在0～0.1mg/ml范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系，最低檢出限為1μg，且不受酚類、游離氨基酸和小分子的影響?？捡R斯亮藍(lán)G-250是一種蛋白質(zhì)染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，最大吸收峰在465nm，在酸性溶液中它與蛋白質(zhì)通過范德瓦爾引力結(jié)合形成考馬斯亮藍(lán)G-250-蛋白質(zhì)復(fù)合物時，其最大吸收峰改變?yōu)?95nm。染料與蛋白質(zhì)結(jié)合迅速，大約為2min，結(jié)合物的顏色在1 h內(nèi)穩(wěn)定。

樣品處理方面可以考慮用PBS、HCl-NaCl緩沖液、Tris-HCl緩沖液等代替水提取蛋白質(zhì)，減少pH等環(huán)境干擾。雖然考馬斯亮藍(lán)法有不少優(yōu)點(diǎn)，但由于受到影響的因素較多，優(yōu)化出一套較好的試驗(yàn)條件并不容易。da Silva MA等[8]對此法的機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，認(rèn)為pH、時間、溫度是本方法的重要變量?？捡R斯亮藍(lán)G-250的溶解性與溫度有一定的關(guān)系。但由于溫度的影響具體操作有困難，本試驗(yàn)未對溫度進(jìn)行研究，確定了常用的低溫4℃。在對植物組織粗提液進(jìn)行可溶性蛋白質(zhì)含量測定時，取樣量應(yīng)控制在一個適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，盡可能取樣少些，以減少粗提液對測定結(jié)果可能帶來的影響。

國內(nèi)外對蛋白質(zhì)的分離提取已有多年的研究歷史，尤其對大豆蛋白[9]、肉類蛋白[10]等都有深入的研究。而對于芡實(shí)，除了在保鮮儲藏、淀粉特性[11]、多糖特性[12]、中藥指紋圖譜[13]等方面有相關(guān)論文發(fā)表外，對芡實(shí)蛋白質(zhì)的研究，如酸性、水溶性、鹽溶性蛋白含量等方面報道均較少。水溶性植物功能蛋白是一類具有高水溶性、高蛋白質(zhì)含量、高熱穩(wěn)定性，以及強(qiáng)乳化能力（“三高一強(qiáng)”）的功能蛋白。芡實(shí)藥材水溶性蛋白質(zhì)的研究可為藥食兩用植物的資源綜合利用提供新的方向。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:151.

[2]陳蓉，吳啟南，沈蓓.不同產(chǎn)地芡實(shí)氨基酸組成分析與營養(yǎng)價值評價[J].食品科學(xué)，2011，32（15）:239.

[3]譚五豐，杜冰，謝藍(lán)華，等.響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取芡實(shí)蛋白工藝[J].農(nóng)業(yè)工程，2014，4（4）:82.

[4]韓利梅.芡實(shí)對糖尿病腎病大鼠腎組織SOCS-3、IGF-1表達(dá)的影響[D].太原:山西醫(yī)科大學(xué)，2014.

[5]董文華.芡實(shí)對糖尿病腎病大鼠腎組織GLUT1及TGF-β1表達(dá)的影響[D].太原:山西醫(yī)科大學(xué)，2014.

[6]王麗娟，劉訓(xùn)紅，丁玉華，等.麋角超細(xì)粉體表征及其水溶性蛋白質(zhì)溶出度研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，26（2）:132.

[7]曲春香，沈頌東，王雪峰，等.用考馬斯亮藍(lán)測定植物粗提液中可溶性蛋白質(zhì)含量方法的研究[J].蘇州大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2006，22（2）:82.

[8]da Silva MA，Arruda MA.Mechanization of the Bradford reaction for the spectrophotometric determination of total proteins[J].Anal Biochem，2006，351（1）:155.

[9]趙宇明，姜俊，張建寧，等.光度法快速測定大豆水溶性蛋白質(zhì)的研究[J].大豆科學(xué)，2010，29（1）:124.

[10]邱葵，司天潤.用考馬斯亮藍(lán)測定動物藥材中可溶性蛋白質(zhì)含量方法初探[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2007，14（4）:49.

[11]張汆，侯長平，孫艷輝，等.芡實(shí)淀粉糊黏度特性研究[J].中國糧油學(xué)報，2010，25（4）:20.

[12]陳蓉，薛滿，陳偉，等.芡實(shí)多糖理化性質(zhì)及抗氧化活性研究[J].中國藥學(xué):英文版，2014，23（8）:578.

[13]陳蓉，陳廣云，沈蓓，等.基于共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析法的芡實(shí)紅外指紋圖譜研究[J].中國藥房，2012，23（23）:2141.