黃亞輝，董國強，張萬年，盛春泉（第二軍醫(yī)大學藥學院，上海 200433）

?綜述?

酪氨酸-DNA磷酸二酯酶抑制劑的研究進展

黃亞輝，董國強，張萬年，盛春泉（第二軍醫(yī)大學藥學院，上海 200433）

酪氨酸-DNA磷酸二酯酶Ⅰ（tyrosyl-DNA-phosphodiesteraseⅠ，TdpⅠ）是一個具有催化3′磷酸酪氨酸鍵水解活性的蛋白質(zhì)，該鍵在拓撲異構(gòu)酶Ⅰ（topoisomeraseⅠ，TopⅠ）與DNA相互作用時就會形成。由于TdpⅠ具有修復TopⅠ-DNA復合物、抵消TopⅠ抑制劑作用的功能，因而與TopⅠ共同被認作是潛在治療靶標。TdpⅠ抑制劑不僅與TopⅠ抑制劑（喜樹堿類）起到協(xié)同作用，還能增強博來霉素、TopⅡ抑制劑（依托泊苷、多柔比星）以及DNA烷化劑作用。綜述目前報道的TdpⅠ抑制劑研究進展，重點介紹其作用機制、生物活性及構(gòu)效關系。

酪氨酸-DNA磷酸二酯酶Ⅰ（TdpⅠ）；拓撲異構(gòu)酶Ⅰ（TopⅠ）；抗腫瘤藥物；構(gòu)效關系

作為一個生命體眾多重要細胞過程中的關鍵酶，真核生物的拓撲異構(gòu)酶Ⅰ（TopⅠ）通過解開DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，將存儲的基因信息經(jīng)由復制、轉(zhuǎn)錄和修復過程得以釋放并發(fā)揮作用［1，2］。機制研究發(fā)現(xiàn)，TopⅠ上酪氨酸723的羥基作為親核基團進攻DNA磷酸二酯鍵，將5′末端替代為3′末端，形成所謂的“斷鍵復合物”（TopⅠcomplex cleavage，TopⅠcc）［3，4］。通常情況下，斷裂的DNA會被迅速縫合，TopⅠ-DNA斷鍵復合物也只會短暫存在。然而，一旦該復合物被內(nèi)源性物質(zhì)（包括胸腺嘧啶二聚體、堿基配對錯誤、堿基缺失等）或者外源性物質(zhì)（包括喜樹堿、依托泊苷等）的DNA損傷“抓住”，便將長時間存在于細胞中，進而在復制叉與轉(zhuǎn)錄復合物相撞后，造成細胞DNA破壞［4，5］。因此，為保證細胞的生存，就必須修復這些損傷。

TopⅠcc的修復機制復雜，涉及若干條通路。其中一條涉及到酪氨酸-DNA磷酸二酯酶Ⅰ（TdpⅠ），它催化TopⅠ上酪氨酸基團與DNA的3′磷酸之間共價鍵的水解［6，7］。此外，最近有研究表明TdpⅠ也是堿基修復通路（base excision repair，BER）的一員［8，9］。多核苷酸激酶磷酸酶（PNKP）和XRCC1蛋白質(zhì)，加上其他BER蛋白質(zhì)，比如DNA聚合酶β、DNA連接酶Ⅲ和PARP-1，形成一個多蛋白DNA修復復合物［10］。TdpⅠ與XRCC1復合物一起修復TopⅠcc。3′磷酸末端隨后被PNKP切除，產(chǎn)生3′羥基，接著由DNA多聚酶β代替缺失的DNA片段，最后由DNA連接酶Ⅲ重新縫合DNA（圖1）［11］。更有研究表明，人類TdpⅠ活性位點上純合子H493R突變會導致罕見的常染色體神經(jīng)退行性疾病——伴軸突性神經(jīng)病小腦萎縮（SCAN1）［12］，這也進一步突出TdpⅠ在中央神經(jīng)系統(tǒng)中的重要性。盡管SCAN1患者并沒有表現(xiàn)出明顯的細胞功能障礙，但是TdpⅠ敲除小鼠及SCAN1突變細胞都表現(xiàn)出對喜樹堿（CPT）的高度敏感［13-16］。而當細胞中TdpⅠ過度表達則會導致CPT或者依托泊苷介導的DNA損傷減少，甚至出現(xiàn)耐藥性［17，18］。

除了TdpⅠ之外，其他通路同樣可以修復CPT誘導的DNA損傷，比如DNA修復（XPF、ERCC1、M re11、CtIP），同源結(jié)合（BRCA1、BRCA2、CtIP、M re11、Rad52）和細胞周期檢查點信號傳導（Rad9、BRCA1、BRCA2、p53）［19］。當這些通路失活，細胞很可能更多地依賴TdpⅠ修復CPT介導的DNA損傷。由于很多腫瘤細胞在一條或者多條DNA損傷修復通路上存在缺陷，因此，抑制TdpⅠ依賴通路，便可選擇性地使得腫瘤細胞比正常細胞對TopⅠ抑制劑的敏感度高［2，20］。

在此，針對目前已記錄的TdpⅠ抑制劑，我們作一簡要總結(jié)，并說明該領域需要進一步研究的問題。

1 氨基糖苷類抗生素和核糖體抑制劑

出于TdpⅠ屬于磷酸酶D超家族一員的緣故，首先進行TdpⅠ抑制活性測試的便是該家族其他成員的抑制劑（圖1），比如新霉素（neomycin）［21］。測試重組TdpⅠ酶體外生化活性結(jié)果顯示，新霉素能抑制TdpⅠ，但是要求高濃度。其抑制活性比釩酸鹽（公認的磷酸酶常規(guī)抑制劑）還要弱一些。此外，還測試了新霉素的2個衍生物——巴龍霉素（paromomycin）和利維霉素（lividomycin）的活性［21］，結(jié)果表明它們只有輕微的TdpⅠ抑制活性?？紤]到這些氨基糖苷類化合物都是抑制細菌核糖體，因此對其他的核糖體抑制劑以同樣方法進行篩選。所有經(jīng)測試的氨基糖苷類和非氨基糖苷類抗生素在毫摩爾級均顯示出弱的抑制活性。盡管活性并不理想，機制也不清楚，但是這為其他TdpⅠ抑制劑的鑒定建立了一個可靠的體外分析系統(tǒng)。

圖1 新霉素、巴龍霉素和利維霉素的結(jié)構(gòu)圖

2 四環(huán)素類

通過兩獨立高通量篩選鑒定出包括羅利環(huán)素（rolitetracycline）［21］在內(nèi)的大量四環(huán)素化合物，均可作為TdpⅠ抑制劑的潛在化合物（圖2）。早期研究結(jié)果顯示，四環(huán)素類的抑制作用為微摩爾級，但是缺少明顯的構(gòu)效關系。這類化合物的潛力需要進一步研究。

圖2 羅利環(huán)素的結(jié)構(gòu)圖

3 furamidine（NSC 305831）

采用高通量電化學發(fā)光分析方法，對美國國立癌癥研究所（NCI）發(fā)展治療項目中1 981個化合物進行篩選，發(fā)現(xiàn)了furam idine（NSC 305831）在微摩爾濃度下具有TdpⅠ抑制活性（圖3）［22］。目前該藥作為抗非洲錐蟲病正在進行Ⅲ期臨床試驗。其對單鏈和雙鏈底物均有效，不過對雙鏈DNA的活性更強一些。表面等離子共振研究表明，furamidine能夠連接DNA單鏈和雙鏈，盡管單鏈連接更弱。因此，對TdpⅠ的抑制活性部分可能是由于furamidine連接到DNA所致。但是，furam idine對TdpⅠ的抑制作用依賴底物DNA序列。其動力學與藥物連接到酶的反應速度和持續(xù)時間有關。

另外2個聯(lián)脒化合物——貝尼爾（berenil）和戊烷脒（pentamidine）則活性更弱（圖3）。兩者與furamidine享有相似的整體彎曲結(jié)構(gòu)，只是中間的連接基團不一樣，furam idine所含的是呋喃環(huán)，這暗示呋喃基團對TdpⅠ抑制活性很重要。

圖3 furam idine、貝尼爾和戊烷脒的結(jié)構(gòu)圖

4 磷酸酪氨酸類似物

經(jīng)高通量篩選得到2個有潛在抑制活性的化合物——甲基-3，4-dephostatin［23］和甾體化合物NSC88915［24］，作為磷酸酪氨酸底物，兩者具有相似的結(jié)構(gòu)特征（圖4）。前者是芳香胺類衍生物，帶有羥基取代的苯環(huán)，與TdpⅠ底物中連接到酪氨酸基團的磷酸非常相似。后者及其衍生物包含一個連接至甾體的芳磺酰酯基團，該基團模擬磷酸基，一邊連接到酪氨酸基團，另一邊連接DNA寡核苷酸。

構(gòu)效關系研究表明，dephostatin與甲基-3，4-dephostatin的區(qū)別只是芳香環(huán)上一個羥基的位置不同，盡管甲基-3，4-dephostatin在亞微摩爾濃度下具有TdpⅠ抑制活性，但是dephostatin則表現(xiàn)出在相同濃度下幾乎沒有活性。同樣，NSC88915及其5個衍生物在結(jié)構(gòu)上只是芳香環(huán)對位取代基不同。這6個化合物之間的活性差異在10倍以內(nèi)，但是其他不含芳香環(huán)的相關衍生物卻完全沒有活性。

隨后便有研究者運用包括NSC88915及其衍生物在內(nèi)的14個人類TdpⅠ抑制劑中的藥效團特征作為篩選條件，對化學導航艾瑞圖書館（Chem Navigatori Research Library）中2 700萬個可購買樣品進行篩選。一共有46個化合物符合藥效團特征的三維排列，圖5列出了其中8個［25］。通過高通量篩選分析，鑒定出一個吲哚-3-乙酸衍生物作為潛在的TdpⅠ抑制劑，其IC50值為7.94μmol／L。

總之，這些結(jié)構(gòu)及其衍生物表現(xiàn)出新的化學結(jié)構(gòu)類型，并為研發(fā)更高活性的TdpⅠ抑制劑提供了骨架。

圖4 甲基-3，4-dephostatin、NSC88915及其衍生物的結(jié)構(gòu)圖

5 JBIR-21

在一種變形的真菌（RF-I3305）培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)了一個新化合物——JBIR-21（圖6）［26］。該化合物不僅對TdpⅠ有抑制作用（IC50＝18μmol／L），還對癌細胞株具有毒性作用（IC50＝3.5～13μmol／L）。此外，JBIR-21在小鼠移植瘤模型中還顯示出抗腫瘤活性，而且沒有發(fā)現(xiàn)副作用。

6 首個TdpⅠ-TopⅠ雙重抑制劑

上述介紹的抑制劑均是單靶標抑制劑，鑒于TopⅠ抑制劑的使用容易產(chǎn)生耐藥性，設計合成出一個同時對TopⅠ和TdpⅠ具有雙重抑制作用的化合物的設想，在一個多氨基雙吲哚異喹啉分子（IC50＝1.52±0.05μmol／L）上得以實現(xiàn)（圖7）［27］。這也是目前已知的第一個具有TdpⅠ和TopⅠ雙重抑制的分子，其中化合物145是目前已知活性最高的TdpⅠ抑制劑。但是，構(gòu)效關系研究發(fā)現(xiàn)，對NSC88915活性至關重要的磺酰酯基團在該類分子上不起作用。對先導化合物的優(yōu)化可以推導出以下結(jié)論：①質(zhì)子化的氨基和TdpⅠ活性位點之間的電荷互補可能對高效能有用；②連接氨基和雜環(huán)之間的多亞甲基的疏水性對活性也有貢獻。

這激動人心的結(jié)果具有以下重大意義：①吲哚異喹啉類分子證明了將TopⅠ和TdpⅠ抑制作用融合到一個小分子是可能的，并且是第一個證據(jù)；②這類化合物的獨特結(jié)構(gòu)特征賦予其巨大的操作空間，使得藥動學的可調(diào)節(jié)性大于其他類TdpⅠ抑制劑；③為新的雙重TopⅠ-TdpⅠ抑制劑提供了先導化合物；④促進了基于結(jié)構(gòu)的藥物設計方法。

圖5 虛擬篩選得到的部分化合物結(jié)構(gòu)圖

圖6 JBIR-21的結(jié)構(gòu)圖

圖7 多氨基雙吲哚異喹啉的結(jié)構(gòu)圖

7 5-亞芳基硫代噻唑烷二酮類

Wang等［28］通過篩選一個自身的酪氨酸磷酸化抑制劑化合物庫，找到化合物8（圖8），并在此基礎上發(fā)現(xiàn)了5-亞芳基硫代噻唑烷二酮類作為TdpⅠ抑制劑的全新骨架。經(jīng)過構(gòu)效關系（SAR）研究，發(fā)現(xiàn)其中化合物50（圖8）對TdpⅠ的抑制活性達到亞微摩爾級（IC50＝0.87μmol／L）。一些衍生物對全細胞提取物中的TdpⅠ存在抑制活性。這為TdpⅠ抑制提供了進一步的解釋。

圖8 化合物8和50的結(jié)構(gòu)圖

8 總結(jié)與展望

從TdpⅠ抑制劑的發(fā)展來看，其設計與合成經(jīng)歷了從盲目到合理，從單靶點到多靶點的過程。抑制活性逐步提高，有效濃度從當初的毫摩爾級提升到微摩爾級。毫無疑問，目前活性最高的屬5-亞芳基硫代噻唑烷二酮類（IC50＝0.87μmol／L）。

但是，這其中還存在很多不足，比如活性分子整體數(shù)量較少，且大部分化合物的活性不盡如人意。其發(fā)現(xiàn)存在很大的偶然性，沒有形成較為系統(tǒng)的構(gòu)效關系。當然這與TdpⅠ自身的底物不明確和作用機制尚了解不全存在密切關系。

［1］ Wang JC.DNA topoisomerases［J］.Annu Rev Biochem，1996，65：635-692.

［2］ Pomm ier Y.Topoisomerase I inhibitors：camp tothecins and beyond［J］.Nat Rev Cancer，2006，6（10）：789-802.

［3］ Cham poux JJ.DNA topoisomerases：structure，function，and mechanism［J］.Annu Rev Biochem，2001，70：369-413.

［4］ Pourquier P，Pomm ier Y.Topoisomerase I-mediated DNA damage［J］.Adv Cancer Res，2001，80：189-216.

［5］ Pourquier P，Pilon AA，Kohlhagen G，et al.Trapping of mammalian topoisomerase I and recombinations induced by damaged DNA containing nicks or gaps.Importance of DNA end phosphorylation and camptothecin effects［J］.J Biol Chem，1997，272（42）：26441-26447.

［6］ Yang SW，Burgin AB，，Huizenga BN Jr，etal.A eukaryotic enzyme that can disjoin dead-end covalent complexes betw een DNA and type I topoisomerases［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1996，93（21）：11534-11539.

［7］ Pouliot JJ，Yao KC，Robertson CA，et al.Yeast gene for a Ty r-DNA phosphodiesterase that repairs topoisomerase I complexes［J］.Science，1999，286（5439）：552-555.

［8］ El-Kham isy SF，Saifi GM，Weinfeld M，et al.Defective DNA single-strand break repair in spinocerebellar ataxia w ith axonal neuropathy-1［J］.Nature，2005，434（7029）：108-113.

［9］ Plo I，Liao ZY，Barcelo JM，et al.Association of XRCC1 and tyrosyl DNA phosphodiesterase（Tdp1）for the repair of topoisomerase I-mediated DNA lesions［J］.DNA Repair（Am st），2003，2（10）：1087-1100.

［10］ W hitehouse CJ，Taylor RM，Thistlethw aite A，et al.XRCC1 stimulates human polynucleotide kinase activity at damaged DNA termini and accelerates DNA single-strand break repair［J］.Cell，2001，104（1）：107-117.

［11］ Pomm ier Y，Redon C，Rao VA，et al.Repair of and checkpoint response to topoisomerase I-mediated DNA damage［J］.Mutat Res，2003，532（1-2）：173-203.

［12］ Takashima H，Boerkoel CF，John J，et al.M utation of TDP1，encoding a topoisomerase I-dependent DNA damage repair enzyme，in spinocerebellar ataxia with axonal neuropathy［J］.Nat Genet，2002，32（2）：267-272.

［13］ El-Khamisy SF，Katyal S，Patel P，et al.Synergistic decrease of DNA single-strand break repair rates in mouse neural cells lacking both Tdp1 and aprataxin［J］.DNA Repair（Am st），2009，8（6）：760-766.

［14］ Das BB，Antony S，Gup ta S，et al.Optimal function of the DNA repair enzyme TDP1 requires its phosphorylation by ATM and／or DNA-PK［J］.EMBO J，2009，28（23）：3667-3680.

［15］ Katyal S，el-Kham isy SF，Russell HR，et al.TDP1 facilitates chromosomal single-strand break repair in neurons and is neurop rotective in vivo［J］.EMBO J，2007，26（22）：4720-4731.

［16］ Hirano R，Interthal H，Huang C，et al.Spinocerebellar ataxia w ith axonal neuropathy：consequence of a Tdp1 recessive neomorphic mutation？［J］.EMBO J，2007，26（22）：4732-4743.

［17］ Barthelmes HU，Habermeyer M，Christensen MO，et al.TDP1 overexp ression in human cells counteracts DNA damagemediated by topoisomerases I and II［J］.J Biol Chem，2004，279（53）：55618-55625.

［18］ Nivens MC，F(xiàn)elder T，Galloway AH，et al.Engineered resistance to camp tothecin and antifolates by retroviral coexpression of tyrosyl DNA phosphodiesterase-Iand thym idy late synthase［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2004，53（2）：107-115.

［19］ Pomm ier Y，Barcelo JM，Rao VA，et al.Repair of topoisomerase I-mediated DNA damage［J］.Prog Nucleic Acid Res Mol Biol，2006，81：179-229.

［20］ Dexheimer TS，Antony S，Marchand C，etal.Tyrosyl-DNA phosphodiesterase as a target for anticancer therapy［J］.Anticancer Agents Med Chem，2008，8（4）：381-389.

［21］ Liao Z，Thibaut L，Jobson A，etal.Inhibition of human tyrosyl-DNA phosphodiesterase by aminoglycoside antibiotics and ribosome inhibitors［J］.M ol Pharmacol，2006，70（1）：366-372.

［22］ Antony S，M archand C，Stephen AG，et al.Novel highthroughput electrochem ilum inescent assay for identification of human ty rosy l-DNA phosphodiesterase（Tdp1）inhibitors and characterization of furam idine（NSC 305831）as an inhibitor of Tdp1［J］.Nucleic Acids Res，2007，35（13）：4474-4484.

［23］ Marchand C，Lea WA，Jadhav A，et al.Identification of phosphoty rosine m imetic inhibitors of human ty rosy l-DNA phosphodiesterase I by a novel A lphaScreen high-throughput assay［J］.Mol Cancer Ther，2009，8（1）：240-248.

［24］ Dexheimer TS，Gediya LK，Stephen AG，et al.4-Pregnen-21-ol-3，20-dione-21-（4-bromobenzenesulfonate）（NSC 88915）and related novel steroid derivatives as tyrosyl-DNA phosphodiesterase（Tdp1）inhibitors［J］.JM ed Chem，2009，52（22）：7122-7131.

［25］ Weidlich IE，Dexheimer T，M archand C，et al.Inhibitors of human tyrosyl-DNA phospodiesterase（hTdp1）developed by virtual screening using ligand-based pharmacophores［J］.Bioorg Med Chem，2010，18（1）：182-189.

［26］ Takagi M，Ueda JY，Hwang JH，et al.Ty rosyl-DNA phosphodiesterase 1 inhibitor from an anamorphic fungus［J］.J Nat Prod，2012，75（4）：764-767.

［27］ Nguyen TX，M orrell A，Conda-Sheridan M，et al.Synthesis and biological evaluation of the first dual tyrosyl-DNA phosphodiesterase I（Tdp1）-topoisomerase I（Top1）inhibitors［J］.JMed Chem，2012，55（9）：4457-4478.

［28］ Sirivolu VR，Vernekar SK，Marchand C，etal.5-A rylidenethioxothiazolidinones as inhibitors of tyrosyl-DNA phosphodiesterase I［J］.JM ed Chem，2012，55（20）：8671-8684.

Recent advances of tyrosyl-DNA phosdiesteraseⅠ（TdpⅠ）inhibitors

HUANG Yahui，DONG Guoqiang，ZHANGWannian，SHENG Chunquan（School of Pharmacy，Second M ilitary Medical University，Shanghai200433，China）

Tyrosyl-DNA phosphodiesteraseⅠ（TdpⅠ）is a recently discovered proteinthat catalyzes the hydrolysis of 3′-phosphotyrosyl bonds.Such linkages form in vivo during the interaction of DNA and topoisomeraseⅠ（TopⅠ）.TdpⅠhas been regarded as a potential therapeutic co-targetof TopⅠbecause ithas the functions of repairing TopⅠcompound and counteracting the effects of TopⅠinhibitors.TdpⅠinhibitors can not only synergizing w ith TopⅠ-targeting drugs（camptothecins），but also strength the function of bleomycin，topoisomeraseⅡ（TopⅡ）inhibitors（etoposide，doxorubicin）and DNA alkylating agents.We summarized the researching advance of TdpⅠinhibitors and focused on the introduction of themechanism，bioactivity and structure-activity relationship.

tyrosyl-DNA phosphodiesteraseⅠ（TdpⅠ）；topoisomeraseⅠ（TopⅠ）；anti-tumor inhibitors；structure and activity relationship

R979.1

A

1006-0111（2015）04-0298-05

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.04.003

2014-07-14

2014-10-27［本文編輯］李睿旻

國家優(yōu)秀青年科學基金（No.81222044）

黃亞輝，碩士研究生.Tel：18521509547；E-mail：xiaohnhyh＠163.com

盛春泉，教授，博士生導師.研究方向：抗感染和抗腫瘤藥物化學研究.Tel：（021）81871239；E-mail：shengcq＠hotmail.com