肖志軍，郭潔文，徐 峰（.上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，上海 0400；.廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣州 5030）

?論著?

荔枝核皂苷和荔枝核黃酮對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗作用研究

肖志軍1，郭潔文2，徐 峰1（1.上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，上海 201400；2.廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣州 510130）

目的探討荔枝核皂苷、荔枝核黃酮對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞糖代謝的影響。方法采用高濃度胰島素培養(yǎng)基誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞形成胰島素抵抗模型，葡萄糖氧化酶法測(cè)定對(duì)照組、荔枝核皂苷組、荔枝核黃酮組、羅格列酮組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的葡萄糖含量，觀察荔枝核皂苷、荔枝核黃酮對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的作用。結(jié)果HepG2細(xì)胞在10－6mol／L的胰島素中作用24 h，細(xì)胞對(duì)胰島素的抵抗作用最為明顯。以此條件構(gòu)建胰島素抵抗細(xì)胞模型，對(duì)該模型給予荔枝核皂苷、荔枝核黃酮干預(yù)后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡葡糖含量未能顯著降低。結(jié)論本研究提示荔枝核皂苷、荔枝核黃酮不能有效改善胰島素抵抗。

荔枝核皂苷；荔枝核黃酮；胰島素抵抗；HepG2細(xì)胞

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是指胰島素敏感組織如肝、脂肪、骨骼肌等受胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取和利用能力減弱的一種病理和生理狀態(tài)［1］。IR是高血壓、2型糖尿病和脂肪肝、肥胖等代謝性疾病并發(fā)和相互聯(lián)系的病理學(xué)基礎(chǔ)。中藥具有多成分、多作用靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，可能通過(guò)不同的途徑和環(huán)節(jié)來(lái)改善IR［2］。因此，尋找、研究改善IR的中藥日益被重視。

荔枝核為無(wú)患子科植物荔枝（Litchi chinensis Soon.）的干燥成熟種子，其活性成分主要有總皂苷、黃酮、多糖、多酚等。本課題組前期研究表明［3-7］，荔枝核水提取物對(duì)高糖、高脂飲食加低劑量鏈脲霉素誘導(dǎo)的T2DM-IR動(dòng)物模型，荔枝核總皂苷對(duì)高糖、高脂飲食誘導(dǎo)高脂血癥-IR-脂肪肝與地塞米松致IR兩種動(dòng)物模型均有顯著的降糖、調(diào)脂和改善IR作用。

因此，為深入研究荔枝核改善IR的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)擬采用超生理濃度的胰島素刺激人肝癌細(xì)胞HepG2，建立具有IR特點(diǎn)的細(xì)胞模型，進(jìn)一步觀察在細(xì)胞形成IR的情況下，荔枝核提取物皂苷和黃酮能否有效改善IR細(xì)胞模型的葡萄糖利用和攝取。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 HepG2細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥品與試劑 荔枝核皂苷和荔枝核黃酮由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所林麗靜博士分離并提供樣品。DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（Biochrom公司），0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液、青霉素-鏈霉素混合液（Hyclone公司），胰島素、羅格列酮標(biāo)準(zhǔn)品、MTT、DMSO（Sigma公司），葡萄糖測(cè)定試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。

1.3 主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific公司），超凈工作臺(tái)（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司），倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司），高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞HepG2在添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)。HepG2細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后，棄培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗2次，0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 HepG2胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立 參考文獻(xiàn)［8］方法并加以改進(jìn)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后，用含2%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×106／L，接入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，分為對(duì)照組和模型組。待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)至80%后，模型組加入新配制的含胰島素濃度為10－5、10－6、10－7、10－8mol／L的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入正常培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育36 h后，用葡萄糖氧化酶法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量。計(jì)算對(duì)照組與不同胰島素濃度組細(xì)胞的葡萄糖含量消耗差值，選擇葡萄糖消耗差值最大，即達(dá)到胰島素抵抗最高狀態(tài)的胰島素作用濃度為胰島素最佳濃度。

確定胰島素最佳濃度后，重復(fù)上述方法，模型組加入新鮮配制的含有胰島素最佳濃度的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)12、24、36和48 h，對(duì)照組加入正常培養(yǎng)基。計(jì)算對(duì)照組和模型組細(xì)胞的葡萄糖消耗量差值。選擇葡萄糖消耗量差值最大，即達(dá)到胰島素抵抗最高狀態(tài)的胰島素作用時(shí)間為胰島素作用的最佳時(shí)間。通過(guò)分別確定最佳胰島素濃度和最佳作用時(shí)間后，建立最適宜的胰島素誘發(fā)的HepG2胰島素抵抗細(xì)胞模型。

1.4.3 M TT法篩選荔枝核皂苷、荔枝核黃酮工作濃度 建立HepG2胰島素抵抗細(xì)胞模型后，將細(xì)胞接種于96孔板，每孔約5 000個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)荔枝核皂苷組、荔枝核黃酮組、對(duì)照組。荔枝核皂苷組、荔枝核黃酮組分別加入濃度為0.01、0.1、1、10、50、100 mg／L的荔枝核皂苷和荔枝核黃酮，對(duì)照組加入正常培養(yǎng)基，各實(shí)驗(yàn)組中DMSO的終濃度均＜0.1%。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，每孔加入20μl濃度為5 mg／m l的M TT溶液，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。棄上清液，各孔分別加入100μl的DMSO，微型振蕩器振蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)各孔吸光度（A）。細(xì)胞存活率＝（藥物組A／對(duì)照組A）×100%。

1.4.4 荔枝核皂苷和荔枝核黃酮對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響 建立HepG2胰島素抵抗細(xì)胞模型后，將細(xì)胞接種于96孔板，每孔約5 000個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)HepG2胰島素抵抗細(xì)胞模型組、羅格列酮組（終濃度為10－5mol／L）、荔枝核皂苷組和荔枝核黃酮組。各組加入相應(yīng)的藥物后置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用葡萄糖氧化酶法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本均數(shù)差的多重比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同胰島素濃度對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的影響 從表1可以看出，與對(duì)照組相比，胰島素濃度為10－5、10－6、10－7mol／L時(shí)HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量增加（P＜0.05）。且在胰島素濃度為10－6mol／L時(shí)葡萄糖含量最高，即葡萄糖消耗量最小，達(dá)到最大胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。因此，選擇10－6mol／L為最佳胰島素濃度，建立HepG2胰島素抵抗細(xì)胞模型。

表1 不同濃度胰島素對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的影響（n＝6，±s）

表1 不同濃度胰島素對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的影響（n＝6，±s）

*P＜0.05，與對(duì)照組比較

組別胰島素含量（c B／mol?L－1）葡萄糖含量（c B／mol?L－1）對(duì)照組0 19.694±0.632胰島素組10－521.091±0.215*10－622.459±0.249*10－720.407±0.245*10－819.884±0.280

2.2 胰島素不同作用時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的影響 從表2可以看出，與對(duì)照組相比，胰島素作用時(shí)間為24、36、48 h時(shí)，HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量增加（P＜0.05）。在胰島素作用24 h時(shí)，胰島素抵抗與對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.01）。此外，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞狀態(tài)逐漸變差。因此，選擇10－6mol／L胰島素處理HepG2細(xì)胞24 h為建模條件，建立胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型。

表2 胰島素不同作用時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的影響（n＝6，±s）

表2 胰島素不同作用時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的影響（n＝6，±s）

*P＜0.05，與對(duì)照組比較；**P＜0.01，與對(duì)照組比較

組別葡萄糖含量（cB／mol?L－1）12 h 24 h 36 h 48 h對(duì)照組21.950± 0.549 18.882± 0.097 18.696± 0.111 18.584± 0.124 10－6mol／L胰島素組22.260± 0.185 21.852± 0.634**20.493± 0.193*18.815± 0.169*

2.3 M TT實(shí)驗(yàn)篩選荔枝核皂苷的工作濃度 由圖1可知，HepG2細(xì)胞存活率隨著荔枝核皂苷的濃度增加而降低，當(dāng)荔枝核皂苷濃度為50 mg／L時(shí)，細(xì)胞存活率為（99.44±5.692）%，表明此時(shí)當(dāng)荔枝核皂苷對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)開始產(chǎn)生抑制作用，為了消除因抑制細(xì)胞生長(zhǎng)而對(duì)葡萄糖消耗量產(chǎn)生的影響，本實(shí)驗(yàn)選取50、10、1 mg／L為荔枝核皂苷的工作濃度。

圖1 不同濃度荔枝核皂苷對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響（n＝6，±s）

2.4 M TT實(shí)驗(yàn)篩選荔枝核黃酮的工作濃度 由圖2可知，當(dāng)荔枝核黃酮濃度為50、100 mg／L時(shí)，HepG2細(xì)胞存活率分別為（101.97±7.963）%、（82.38±8.374）%，為了消除因抑制細(xì)胞生長(zhǎng)而對(duì)葡萄糖消耗量產(chǎn)生的影響，本實(shí)驗(yàn)選取50、10、1 mg／L為荔枝核黃酮的工作濃度。

2.5 荔枝核皂苷對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響 由圖3可知，與對(duì)照組相比，荔枝核皂苷濃度為50 mg／L時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量增加，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。羅格列酮組能夠提高葡萄糖消耗量，即具有降血糖作用。

圖2 不同濃度荔枝核黃酮對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響（n＝6，±s）

圖3 不同濃度荔枝核皂苷對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響（n＝6，±s）

2.6 荔枝核黃酮對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響 由圖4可知，與對(duì)照組相比，經(jīng)3個(gè)濃度荔枝核黃酮處理后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量有所降低，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。羅格列酮能夠顯著提高胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量，即有降血糖作用。

圖4 不同濃度荔枝核黃酮對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響（n＝6，±s）

3 討論

2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制主要是胰島β細(xì)胞功能障礙和外周組織產(chǎn)生IR，改善IR是治療2型糖尿病的主要研究方向之一［9，10］。肝臟是產(chǎn)生IR的主要組織，胰島素從胰島細(xì)胞分泌后，經(jīng)門靜脈約一半以上被肝攝取。本實(shí)驗(yàn)采用的HepG2細(xì)胞為人的肝胚胎瘤細(xì)胞，保留肝的一般生物學(xué)特性［10］。通過(guò)采用高于生理濃度的胰島素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞，在一定程度上模擬了IR的自然發(fā)病過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，應(yīng)用高胰島素誘導(dǎo)培養(yǎng)法可使HepG2細(xì)胞胰島素刺激的葡萄糖消耗量減少，即發(fā)生IR。

本實(shí)驗(yàn)在成功建立IR HepG2細(xì)胞模型基礎(chǔ)上進(jìn)行，通過(guò)測(cè)定藥物干預(yù)后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量來(lái)判定荔枝核皂苷和荔枝核黃酮改善HepG2細(xì)胞IR的作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，荔枝核皂苷和荔枝核黃酮體外并無(wú)明顯降糖作用。

以往的研究表明，荔枝核降糖的主要功效成分為皂苷［5］、多糖［11］和氨基酸［12］。其中，荔枝核皂苷主要是通過(guò)促進(jìn)外周組織尤其是肌肉、脂肪組織對(duì)葡萄糖的攝取、酵解和利用，提高對(duì)胰島素的敏感性，拮抗胰高血糖作用，從而產(chǎn)生降血糖作用［13］。而本研究的結(jié)果卻表明荔枝核皂苷體外并無(wú)明顯降糖作用，基于此，我們認(rèn)為荔枝核皂苷改善IR的作用部位可能并非位于肝細(xì)胞，而是位于肌肉和脂肪等其他外周組織。

本課題組一項(xiàng)對(duì)荔枝核有效部位群改善3T3-L1脂肪細(xì)胞IR作用的研究表明，荔枝核有效部位群能夠顯著改善IR［14］。雖然本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)一步對(duì)荔枝核化學(xué)成分進(jìn)行細(xì)致研究發(fā)現(xiàn)，荔枝核皂苷不能改善IR，荔枝核黃酮類改善IR作用并不明顯，但這樣的結(jié)果更加提示我們，中藥材的藥效恰恰是一個(gè)整體的效應(yīng)，正所謂“每一味中藥都是一個(gè)小復(fù)方”。中藥有效部位群的作用與進(jìn)一步細(xì)分下去的化學(xué)成分的作用可能難以完全一致，單一化學(xué)成分的藥理活性難以體現(xiàn)有效部位群的作用，與有效部位群的功能主治也不盡相同。構(gòu)成有效部位群的每個(gè)化學(xué)組分，若離開其所在的特定物質(zhì)群或特定復(fù)方環(huán)境，則失去其意義。因此，對(duì)荔枝核降糖作用的研究，或進(jìn)一步推廣到對(duì)中藥的研究，應(yīng)著眼于有效部位群。

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Effect of litchi saponin and litchi flavones on insulin resistance in HepG 2 cells

XIAO Zhijun1，GUO Jiewen2，XU Feng1（1.Department of Pharmacy，F(xiàn)engxian Central Hospital，Shanghai 201400，China；2.Guangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510130，China）

ObjectiveTo study the effect of litchisaponin and flavones on glycometabolism in insulin resistancemodelof HepG2 cells.MethodsUsing high insulin in HepG2 cells to establish a cellmodelof insulin resistance.Cellmodelwas treated by litchisaponin，litchi flavones and rosiglitazone，respectively.Glucose concentration of cell culture supernatantwas detected by glucose oxidasemethod.ResultsIn the concentration of 10－6mol／L insulin for 24 hours，HepG2 reached the highest level of resistant to insulin，whichmeans a successful insulin resistance cellmodelwas established.However，no significant decrease in glucose concentration of cell culture supernatantwas observed w ith litchisaponin and flavones.ConclusionThis study suggests that litchi saponin and flavones have no effect to improve insulin resistance.

litchi saponin；litchi flavones；insulin resistance；HepG2 cells

R285

A

1006-0111（2015）04-0316-04

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.04.007

2015-04-22

2015-06-06［本文編輯］李睿旻

上海市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研基金（No.2012Y010A）

肖志軍，藥師.研究方向：中藥藥理學(xué).E-mail：zhijxiao＠163.com

徐 峰，主任藥師.研究方向：臨床藥理學(xué).Tel（021）57422032；E-mail：andrew fxu＠sina.com