尹中普，孫 曉

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院1.耳鼻喉頭頸外科;2.消化內(nèi)科，河南 南陽(yáng)473003)

鼻咽癌是發(fā)生在鼻咽黏膜的一種惡性腫瘤，具有高度侵襲和轉(zhuǎn)移的特性。鼻咽癌的發(fā)病涉及多個(gè)癌基因與抑癌基因的共同參與，通過癌基因和抑癌基因之間相互作用的失常，導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖產(chǎn)生癌變，進(jìn)而發(fā)生癌癥。

miRNA 在腫瘤形成中發(fā)揮重要的作用[1]，主要參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和黏附等過程的調(diào)控。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的miRNA 約有700多種，其中已有多項(xiàng)研究表明miRNA-205 在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[2-3]，提示miRNA-205 可能是一種潛在的致癌基因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣本收集:隨機(jī)收集南陽(yáng)市中心醫(yī)院2012年5月至2014年1月原發(fā)性鼻咽癌組織樣本41例，鼻咽炎黏膜組織樣本38例和正常鼻咽黏膜組織樣本43例。所有活體組織均經(jīng)過病理學(xué)確診，年齡＞18歲。所有樣本獲取時(shí)得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意。

1.1.2 試劑:鼻咽癌細(xì)胞系CNE1、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和LipofectamineTM2000(Invitrogen 公司);miRNA-205-mimic/inhibitor(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成);抗cyclin D1 和抗P21 抗體(Santa Cruz 公司)，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 鼻咽黏膜組織中miRNA-205的mRNA表達(dá):按照Trizol說明書操作。miRNA-205 上游引物:5'-CGTCCAACATTCC ACCG-3'，下游引物為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3';β-actin:上游引物為5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'，下游引物為5'-ATTCGCACTGGATACGACCAGACTC-3'。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組:將CNE1 置于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液內(nèi)，培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。組別分為空白對(duì)照組(con);陰性對(duì)照組(negative control-mimics，NC-m 或negative control-inhibitor，NC-i);轉(zhuǎn)染組(miRNA-205-mimics，205-m 或 miRNA-205-inhibitor，205-i)。按 LipofectamineTM2000 說明書操作，將miRNA-205-mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染到CNE1。

1.4 MTT 比色法測(cè)定細(xì)胞增殖曲線:于細(xì)胞處理結(jié)束前4 h，加入MTT 溶液，培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，加入DMSO，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm 處測(cè)量吸光值(A570nm)，并繪制增殖曲線。

1.5 黏附實(shí)驗(yàn):接種細(xì)胞于Fn 預(yù)包被的細(xì)胞培養(yǎng)板，靜置15、30 和45 min后，收集黏附細(xì)胞，計(jì)算黏附百分率。

1.6 cyclinD1 和P21的蛋白表達(dá):提取細(xì)胞蛋白，定量，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉液封閉1 h，加入一抗孵育，繼而加入相應(yīng)二抗孵育，熒光顯色。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)各組織中miRNA-205的表達(dá):鼻咽癌組織的miRNA-205表達(dá)比鼻咽炎組織和正常鼻咽黏膜組織高(P＜0.05)(圖1，表1)

圖1 各組織中miRNA-205的表達(dá)Fig1 miRNA-205 expression in various tissues

表1 各組織中miRNA-205的表達(dá)Table1 miRNA-205 expression in various tissues(±s，n=6)

表1 各組織中miRNA-205的表達(dá)Table1 miRNA-205 expression in various tissues(±s，n=6)

＊P＜0.05 compared with control group.

group miRNA-205 con(n=43)1.00±0.00 nasopharyngitis tissues (n=38) 1.07±0.04 nasopharyngeal carcinoma tissues (n=41) 5.89±0.18*

2.2 MTT 比色法測(cè)定增殖曲線:205-m 組細(xì)胞的增殖速度顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，而205-i 組則顯著低于對(duì)照組(圖2)。

圖2 CNE1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-205-mimics/inhibitor后的增殖曲線Fig2 Effects of miRNA-205 on CNE1 cell proliferation(±s，n=6)

圖3 CNE1 細(xì)胞黏附曲線Fig3 Adhesion curve of CNE1 cells (±s，n=3)

2.3 黏附實(shí)驗(yàn):205-m 組細(xì)胞與對(duì)照組相比，30 和45 min后細(xì)胞的黏附效率均顯著增加(P＜0.05)，而205-i 組則相反(圖3)。

2.4 Cyclin D1 和P21的蛋白表達(dá):與對(duì)照組相比，205-m 組中cyclin D1的表達(dá)顯著增加，P21的表達(dá)卻顯著減少(P＜0.05)，而205-i 組結(jié)果相反(圖4，表2)。

表2 Cyclin D1 和P21的蛋白表達(dá)Table2 Expression of cyclin D1 and P21 in CNE1(±s，n=6)

表2 Cyclin D1 和P21的蛋白表達(dá)Table2 Expression of cyclin D1 and P21 in CNE1(±s，n=6)

＊P＜0.05 compared with control group.

group cyclin D1 P21 con 1.00±0.00 1.00±0.00 NC-m 1.03±0.09 0.97±0.10 NC-i 0.98±0.05 0.99±0.07 205-m 4.32±0.39* 0.63±0.06*205-i 0.75±0.03* 3.42±0.21*

圖4 Cyclin D1 和P21的蛋白表達(dá)Fig4 Western blot analysis of cyclin D1 and P21 in CNE1

3 討論

本研究通過對(duì)鼻咽癌活檢組織、鼻咽炎黏膜組織、正常鼻咽組織進(jìn)行免疫印跡及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中miRNA-205的蛋白和mRNA 水平明顯高于其他兩組中的表達(dá)。過表達(dá)miRNA-205后，鼻咽癌細(xì)胞系CNE1增殖速率和黏附率增加，提示miRNA-205 可能參與了調(diào)控鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程。此外，轉(zhuǎn)染miRNA-205-mimics后，cyclin D1表達(dá)顯著增加，而P21表達(dá)顯著減少，提示miRNA-205 促進(jìn)細(xì)胞系CNE1的增殖通過調(diào)控cyclin D1 和P21的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，miRNA-205 在鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)增加，對(duì)鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，可能起到癌基因的作用，但其具體機(jī)制還不清楚，后期需要進(jìn)一步在體外和體內(nèi)模型進(jìn)行研究。

[1]He L，Hanno GJ.MicroRNAs:small RNAs with a big role in gene regulation[J].Nat Rev Genet，2004，5:522-531.

[2]Orang AV，Safaralizadeh R，Hosseinpour FMA.Insights into the diverse roles of miR-205 in human cancers[J].Asian Pac Cancer Prev，2014，15:577-583.

[3]Cai J，F(xiàn)ang L，Huang Y，et al.MiR-205 targets PTEN and PHLPP2 to augment AKT signaling and drive malignant phenotypes in non-small cell lung cancer[J].Cancer Res，2013，73:5402-5415.