胡庭毅，張 健，陳 瀟，蔡 梟，熊 科

(重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 骨外科， 重慶 404100)

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研究論文

腸源性TPH1、LRP5表達(dá)及血清5-HT水平與雄性大鼠增齡性骨量丟失相關(guān)

胡庭毅，張 健*，陳 瀟，蔡 梟，熊 科

(重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 骨外科， 重慶 404100)

目的觀察不同月齡SD雄性大鼠十二指腸TPH1、LRP5表達(dá)水平及血清5-HT水平，分析其在增齡中的變化及增齡性骨量丟失的相關(guān)性。方法分別選取2、6、12、15和18月齡大鼠各6只，共30只，按照月齡分組以模擬增齡性模型。分別用RT-PCR法、Western blot法檢測十二指腸TPH1和LRP5的mRNA和蛋白表達(dá)，用 ELISA方法檢測血清5-HT水平，雙能骨密度儀測定大鼠離體股骨骨密度。結(jié)果十二指腸TPH1 mRNA和蛋白表達(dá)及血清5-HT水平隨年齡的增長而增加，與增齡性骨量丟失呈負(fù)相關(guān)性(P<0.001)。結(jié)論腸源性5-HT及其關(guān)鍵合成限速酶TPH1表達(dá)在增齡性骨量丟失中發(fā)揮著重要作用，可能成為老年性骨質(zhì)疏松潛在治療干預(yù)靶。

LRP5；TPH1；5-HT；老年性骨質(zhì)疏松

骨組織結(jié)構(gòu)、強(qiáng)度及功能是通過骨吸收和骨形成之間的動態(tài)耦聯(lián)平衡相維系的。隨著年齡的增長，這種微妙平衡逐漸被打破，呈現(xiàn)以骨形成絕對不足為特征的低轉(zhuǎn)換病理狀態(tài)。其過程中骨量逐漸丟失，骨皮質(zhì)變薄及骨小梁紊亂等微結(jié)構(gòu)破壞，最終導(dǎo)致骨脆性增加及病理性骨折。WHO將這種生理病理退行性病變定義為老年性骨質(zhì)疏松癥。衰老作為獨立的危險因素在其發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，且還間接介導(dǎo)了多種機(jī)制影響[1]。近年的研究發(fā)現(xiàn)腸源性5-HT水平通過內(nèi)分泌途徑對骨代謝產(chǎn)生著重要負(fù)性調(diào)控作用[2]。經(jīng)典的骨量調(diào)節(jié)蛋白LRP5可能通過調(diào)節(jié)腸道tryptophan hydroxylase 1(TPH1)表達(dá)而對骨代謝產(chǎn)生影響[3]。本實驗通過研究LRP5/TPH1/5-HT通路與增齡骨量丟失關(guān)系，旨在為增齡相關(guān)骨量丟失尋找潛在的治療干預(yù)靶。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級雄性SD大鼠30只(愛爾麥特科技有限公司，實驗動物許可證號：SCXK蘇2009- 0001)。按照月齡分為2、6、12、15和18月組,每組各6只,分別標(biāo)號為A、B、C、D和E組，以復(fù)制自然衰老大鼠不同年齡階段生理狀況。處理標(biāo)本期間自由攝水，標(biāo)準(zhǔn)飼料自由攝食。溫度(22±2)℃、人工照明晝夜交替12 h∶12 h、相對濕度55%。

1.2 樣本采集處理

術(shù)前腹腔注射10%水合氯醛(10 mL/kg)麻醉后，取動脈血分離血清，-20 ℃凍存。取右側(cè)股骨予剝離附著軟組織，0.9%氯化鈉注射液洗凈，放入標(biāo)本袋中待測。開腹剪取十二指腸標(biāo)本 (距幽門部2 cm),0.9%氯化鈉溶液洗凈，將截取組織用液氮冰凍后，-80 ℃凍存。

1.3 主要試劑

Rabbit-anti-rat TPH1抗體BA1449、Rabbit-anti-rat LRP5抗體BA4305- 2和mouse-anti-rat β-actin抗體BA2305(武漢博士德生物工程公司)；動物組織總RNA提取試劑盒、TIAN script反錄試劑盒和PCR擴(kuò)增試劑盒FP205(天根生化科技有限公司)；5-HT ELISA試劑盒(上海凱博生化試劑有限公司)；PCR引物(上海生工生物有限公司設(shè)計合成)。

1.4 數(shù)據(jù)檢測

1.4.1 股骨骨密度：應(yīng)用雙能X線骨密度儀(Hologic公司, DEXA,QDR4500Fanbeam)及所附Small animal軟件對整段股骨縱向掃描。

1.4.2 RT-PCR法測定LRP5、TPH1 mRNA表達(dá)：參照提取試劑盒(DP431)說明書提取總RNA，據(jù)TIAN script反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA模板，加入上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增。TPH1上游5′-CCTGCAAACA GGAATGTCT- 3′，下游5′-TCTGGACTGATGCTCAAA GG-3′，片段300 bp；LRP5上游5′-GACCTGATGGG ACTCAAAGC-3′，下游5′-TCCAGTAGATGTGGTTGT TGG-3′，片段316 bp；內(nèi)參GAPDH上游5′-TATCGG ACGCCTGGTTAC-3′，下游5′-GGAAGATGGTGATG GGTTT-3′，片段194 bp。凝膠電泳后，成像掃描進(jìn)行半定量分析。

1.4.3 Western blot法測定蛋白表達(dá)：將組織剪碎，混入總蛋白提取試劑冷浴勻漿，經(jīng)過裂解后離心，待變性5min后取上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取?biāo)本上樣后，行SDS-PAGE電泳后，利用濕轉(zhuǎn)移電泳法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。室溫下將膜浸入5%脫脂牛奶中，搖動封閉2 h，再分別與一抗兔抗TPH1(1∶200)、鼠抗β-actin(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。將膜分別與小鼠及兔來源的二抗(分別是1∶1 000和1∶500)孵育2 h，洗膜6次。ECL顯色后照相。圖像分析，測TPH1或LRP5或和β-actin的吸光度比值。

1.4.4 ELISA法檢測血清5-HT水平：按大鼠5羥色胺(5-HT)Elisa試劑盒操作要求檢測血清5-HT水平。取出酶標(biāo)板，依次對應(yīng)分別加入100 μL的標(biāo)準(zhǔn)品于空白微孔中；分別標(biāo)記樣品編號，加入100 μL樣品與空白微孔中；在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中加入50 μL的酶標(biāo)記溶液；(36±2)℃孵育反應(yīng)60 min；洗板5次，每次靜置10～20 min；每孔加入底物A、B液各50 μL； (36±2)℃下避光孵育反應(yīng)15 min；每孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)；于波長450 nm的酶標(biāo)儀上讀取個孔的A值；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以讀取數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同月齡組大鼠股骨骨密度變化

12、15、18月齡組骨密度均數(shù)較6月齡組明顯降低 (P<0.01)(表1)。

2.2 不同月齡組血清5-HT水平變化

各月齡組血清5-HT均值隨著年齡增長逐漸增高，12、15和18月齡組大鼠血清5-HT均值較6月齡組水平顯著升高 (P<0.01)(表1)。

表1 不同月齡組大鼠骨密度及血清5-HT值

*P<0.05，**P<0.01 compared with group A.

2.3 不同月齡組大鼠十二指腸組織TPH1 mRNA表達(dá)情況

12、15和18月齡組較6月齡組TPH1 mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.01)， 12月齡組較6月齡組表達(dá)上調(diào)約1.6倍(P<0.01)，18月齡組較6月齡組表達(dá)上調(diào)約2.5倍(圖1，表2)。

圖1 不同月齡組大鼠TPH1 mRNA表達(dá)變化Fig 1 The expression change of the TPH1 mRNA in rats of different months

2.4 不同月齡組大鼠十二指腸組織TPH1蛋白表達(dá)情況

12、15和18月齡組較6月齡組TPH1蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.01)，18月齡組較6月齡組表達(dá)上調(diào)近3倍(圖2，表2)。

圖2 不同月齡組大鼠TPH1蛋白水平變化Fig 2 The expression change of the TPH1 protein level in rats of different months

2.5 不同月齡階段十二指腸組織LRP5 mRNA表達(dá)情況

各月齡組LRP5 mRNA表達(dá)無明顯年齡變化趨勢(圖3，表2)。

2.6 不同月齡階段十二指腸組織LRP5蛋白表達(dá)情況

各月齡組LRP5蛋白表達(dá)無明顯年齡變化趨勢(圖4，表2)。

圖3 不同月齡組大鼠LRP5 mRNA表達(dá)變化Fig 3 The expression change of the LRP5 mRNA in rats of different months

groupTPH1mRNATPH1protein LRP5mRNALRP5proteinA0067±0013133±006054±013041±007B0076±0012118±012?050±010037±001C0126±0014??221±013??046±006039±005D0174±0013??287±015??055±008044±006E0192±0010??332±021??058±007047±005

*P<0.05，**P<0.01 compared with group A.

圖4 不同月齡組大鼠LRP5蛋白表達(dá)變化Fig 4 The expression change of the LPR5 protein level in rats of different months

2.7 TPH1、LRP5表達(dá)水平及血清5-HT水平與增齡相關(guān)的骨量丟失的相關(guān)性

骨密度與十二指腸TPH1 mRNA呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.001)；與TPH1蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.001)；與血清5-HT水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.001)。

3 討論

外周和中樞5-HT分屬于獨立的功能系統(tǒng)對骨代謝產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[4]。TPH1是外周5-HT合成鏈中關(guān)鍵限速酶，外周中約95% 5-HT由TPH1特異表達(dá)的胃腸嗜鉻細(xì)胞產(chǎn)生，并以十二指腸表達(dá)特異性最高[5]。約不足5% 5-HT以游離形態(tài)存在于血清中，通過循環(huán)作用于遠(yuǎn)端骨組織靶細(xì)胞受體[5- 6]。特異性抑制腸道TPH1表達(dá)或降低外周血清素水平可明顯改善骨量[2,7]。

作為新骨代謝研究熱點，外周5-HT對骨代謝功能機(jī)制已得到了部分詮釋。成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞表面存在著眾多5-HT受體亞型[6]，5-HT正是激活不同的受體亞型通路發(fā)揮生理作用。特異性敲除5-HTR1B的效果和阻斷5-HT的合成一樣會使動物骨量增加，通過作用5-HT1B受體,經(jīng)蛋白激酶A-環(huán)磷酸腺苷(PKA-cAMP)途徑抑制cAMP產(chǎn)生和轉(zhuǎn)錄因子(CREB)的磷酸化, 下調(diào)周期蛋白基因的表達(dá)，從而降低成骨細(xì)胞的增殖[3]。另外5-HT2A受體可能通過PLC-PKC信號途徑對骨代謝產(chǎn)生影響[8]。而5-HT2B的功能作用并未完全闡明，可能通過多種途徑對骨代謝產(chǎn)生影響[6]。

以往研究對其作用機(jī)制和去勢動物的干預(yù)進(jìn)行一定探討，但5-HT是否在增齡性骨量丟失中發(fā)揮作用并未見相關(guān)報道。本實驗通過對不同年齡雄性大鼠研究發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠血清5-HT水平和腸道中TPH1 mRNA、蛋白表達(dá)隨年齡逐漸增高，處于老年階段的18月齡大鼠較成年階段6月齡大鼠血清5-HT水平和TPH1表達(dá)顯著增高。且通過相關(guān)分析顯示，血清5-HT和TPH1 mRNA及蛋白表達(dá)與增齡相關(guān)骨量丟失呈現(xiàn)顯著負(fù)性相關(guān)性。

值得關(guān)注的是，LRP5作為人體主要的骨量調(diào)節(jié)蛋白，除通過經(jīng)典的Wnt信號通路外，可能還通過特異性抑制腸嗜鉻細(xì)胞TPH1表達(dá),從而調(diào)控成骨細(xì)胞增殖[3]。據(jù)此對LRP5研究亦發(fā)現(xiàn)，其在增齡過程中表達(dá)趨于穩(wěn)定，無明顯年齡相關(guān)性。

綜上所述，TPH1/5-HT通路表達(dá)與增齡性骨量丟失呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)性。其關(guān)鍵因子均可能成為增齡性低骨量疾病的潛在治療干預(yù)靶。開發(fā)TPH1抑制劑、相關(guān)單抗生物制劑及針對5-HT功能受體制劑等藥物，可能對老年性骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防與治療有著重要意義。但是外周5-HT來源廣泛，雖然腸道來源的5-HT發(fā)揮了重要作用[2，6]，但自分泌、旁分泌及神經(jīng)途徑來源的5-HT是否也存在作用，且5-HT在人類增齡性骨量丟失中是否也存在相關(guān)等問題仍有待進(jìn)一步研究。

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Relationships between enterogenous TPH1, expression of LRP5, serum level of 5-HT and aging bone mass loss of the male rats

HU Ting-yi, ZHANG Jian*, CHEN Xiao, CAI Xiao, XIONG Ke

(Dept. of Orthopedic Surgery, the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University,Chongqing 404100, China)

Objective To observe the expression levels of duodenal TPH1 and LRP5 as well as the level of serum 5-HT in SD male rats of different months, and analyze their changes with the increase of age and the correlation with aging bone mass loss. Methods Six male SD rats at the age of 2, 6, 12, 15 and 18 months respectively (30 in total) were selected in this study for each group and they were grouped according to their ages so as to simulate the physiological aging model. RT-PCR and Western blot methods were employed respectively in this study to detect the mRNA and the expression of protein level of duodenal TPH1, LRP5 in rats of different months. Moreover, the ELISA method was used to check the level of serum 5-HT and the Dual-energy bone mineral density method was used to determine the bone mineral density of rats’ femurinvitro. Results Both the expression level of the duodenal TPH1 mRNA and protein as well as the level of serum 5-HT increased with the growth of the age, but they showed the negative correlation with the aging bone mass loss(P<0.001). Conclusions The enterogenous 5-HT and the expression of TPH1, which is the key enzymes for the speed limit, play an important role in the aging bone mass loss, and they might become the new potential treatment and intervention targets for senile osteoporosis.

LRP5；TPH1；5-HT；senile osteoporosis

2014- 10- 27

2015- 03- 22

重慶市渝中區(qū)科委基金(20110405)

1001-6325(2015)07-0934-04

R681

A

*通信作者(corresponding author)：iygnituh@foxmail.com