岳慧英，李凱，趙春貴，楊素萍

（華僑大學 生物工程與技術系，福建 廈門 361021）

紫細菌能高效完成光能的捕獲、傳遞和轉化，將光能轉換為生物體可利用的化學能，同時能夠進行與光合磷酸化相偶聯(lián)的生物放氫，是闡明光合作用機理、光合產氫放氫以及光電轉化機理的良好模型［1－3］。紫細菌執(zhí)行光合作用功能的光合元件是由整合在光合內膜上排列規(guī)則的蛋白多肽非共價結合色素輔基構成，主要是由光反應中心（RC）、核心捕光復合體（LH1）和外周捕光復合體（LH2）3種類型的色素蛋白復合體（PPC）組成。其中，LH1和LH2主要進行光能的吸收和傳遞，RC則主要完成光能轉化為化學能。自Blastochloris viridis RC的三維晶體結構［4］成功解析以來，對來自不同種屬PPC的分離純化及其結構與功能研究一直是國際關注熱點［5］。

RC與LH1通常以1∶1的比率緊密相連，LH2不直接與RC相連，它只通過LH1傳遞能量給RC。與RC-LH1不同，LH2的數目和光譜類型具有較強的環(huán)境依賴性。LH2整體結構為8－9個αβ異二聚體組成的空心圓柱體，每個αβ異二聚體非共價結合3個細菌葉綠素（BChl）分子和1個類胡蘿卜素（Car）分子［6］。LH2中BChl與αβ異二聚體特定的氨基酸殘基相互作用，形成B800和B850兩種耦合程度不同的激子環(huán)，其特征吸收峰分別約在800和850 nm，這些特征峰是判定LH2類型的重要指標［6］。在不同種屬間甚至同一菌株中，LH2 B800和B850特征光譜的峰位和相對強度也有所不同，例如，高光培養(yǎng)時，Rhodopseudomonas（Rps.）palustris LH2特征吸收峰為803和857 nm，A803／A857≈0.80－0.90，低光時則顯示800和850 nm 特征峰，A800／A850≈2［7］；Chromatium vinosuim LH2的特征吸收峰為803和857 nm，A803／A857≈1［8］；2 000 lux光照時Rps.acidophila LH2 A803／A857≈0.85，400 lux時則 A803／A857≈1［9］。紅細菌屬如Rhodobacter（Rba.）sphaeroides和Rba.capsulatus LH2特征吸收峰為798和848 nm，在不同報道中A798／A848比值為0.4—0.8［9］。LH2特征吸收峰的差異可歸因于αβ異二聚體堆積疏密程度的不同［10］。

αβ異二聚體由puc BA基因編碼，不同種屬間，由于αβ異二聚體不同，LH2特征吸收峰將產生明顯差異，即使在同一菌株的基因組中往往存在多個不同的pucBA基因，不同pucBA基因表達的αβ異二聚組裝成LH2，由于LH2中αβ異二聚組成不同，也將導致B800和B850吸收光譜變化［7］，從理論上分析，即使在同一菌株中，由于LH2αβ異二聚體組成的差異，將產生多種光譜差異的LH2。目前已有在不同光照條件下從同一菌株獲得不同光譜類型LH2（典型LH2和LH3或LH4）的報道，但未見同一培養(yǎng)條件下從同一菌株中獲得B800－B850吸光度比值不同的LH2的報道。本文以固氮紅細菌（Rba.azotoformans）R7菌株為實驗材料，采用硫酸銨鹽析和蔗糖密度梯度離心結合離子交換層析兩種方法分離PPC，在不同的鹽析梯度下獲得了不同光譜類型的LH2組分，在不同的蔗糖密度梯度下獲得了2種光譜一致的LH2，以期為進一步研究不同光譜類型LH2結構與功能關系奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

固氮紅細菌R7菌株，16S r RNA序列GenBank登錄號EU604757，本實驗室分離鑒定保存。

紫外可見分光光度計（UV-3200，MAPADA）；自動蛋白核酸純化儀（?KTA，Amersham Biosciences）；超速冷凍離心機（Beckman，Amerca）；臺式高速離心機（5417R，Eppendorf）；十二烷基二甲基胺氧化物（LDAO，Fluka）；DEAE-纖維素52（DEAE-52，Whatman）。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基的配制和細菌的光照厭氧培養(yǎng)參照文獻.［3］進行。于30℃和3 000 lux條件下光照厭氧培養(yǎng)。

1.3 菌體破壁及膜蛋白增溶

離心收集菌體，用p H 8.0 10 mmol／L Tris-HCl緩沖液洗滌3次，稱其濕重。按每g濕菌體5 m L緩沖液的比例懸浮細胞，4.1 kpsi壓力破碎5次，向上述破碎后混合液中直接加入終濃度為1%LDAO和0.1 mol／L NaCl，4℃增溶膜蛋白2 h，12 000 r／min離心20 min收集增溶上清液。

1.4 鹽析結合層析分離純化PPC

硫酸銨鹽析參照文獻［11］進行，向增溶上清液中加入固體硫酸銨，使其飽和度達到30%，4℃緩慢攪30 min，靜置30 min，12 000 g離心20 min，收集沉淀并溶解于含有0.1%LDAO的10 mmol／L Tris-HCl緩沖液（p H8.0，TL）中，得到0－30%鹽析組分。上清液再經50%、60%和80%硫酸銨分級分離，得到30%－50%、50%－60%和60%－80%鹽析組分。各鹽析組分經透析和離心后，進行全波長吸收光譜掃描。根據吸收光譜判斷0－30%鹽析組分和80%硫酸銨鹽析后上清中PPC相對含量較少，棄去。分別將30%－50%、50%－60%和60%－80%鹽析組分過濾，并上樣于DEAE-52柱，于4℃下層析，用TL緩沖液進行NaCl梯度洗脫，收集洗脫液并進行光譜測定。

1.5 蔗糖密度梯度離心結合層析分離純化PPC

將增溶上清液置于10%－60%（w／w）蔗糖密度梯度，100 000 g離心2 h（Beckman SW-28轉子）。收集著色較深的條帶，超濾去蔗糖，離心，過濾，上樣于DEAE-52柱，于4℃下層析，方法同上。

1.6 光譜測定

用光程1 cm石英比色杯，于紫外可見分光光度計進行光譜掃描，掃描波長范圍為200～1 000 nm。

Fig.1 Absorption spectra of intact cells（a），wallbreaking treated cells（b）and LDAO solubilization（c）圖1 活細胞（a）、破細胞壁處理的懸液（b）和增溶處理的上清（c）的吸收光譜

2 結果與分析

2.1 菌體破壁及膜蛋白增溶

活細胞、破細胞壁處理以及LDAO增溶破壁細胞懸液上清液的吸收光譜見圖1。結果表明：活細胞含有380、447、476、508、591、802、852和875 nm 波長特征吸收峰的物質。破壁處理后，約280 nm的蛋白峰顯現出來，其中447、476和508 nm 為 Car吸收峰，380、591、802、852和875 nm為BChl a的特征吸收峰。LDAO增溶處理后，各色素吸收峰均明顯增強，位于近紅外區(qū)的BChl a Qy帶吸收峰顯著升高，且發(fā)生1～2 nm的藍移，875 nm肩峰消失，表明PPC與內質膜分離，并且在該過程中LH1遭到0.1%LDAO的破壞［12］。

2.2 PPC分離純化

Fig.2 （A－C）Absorption spectra of the PPC components prepared by ammonium sulfate fractionation（up side）and elution profile during DEAE-52 ion-exchange chromatography（down side）.（D）absorption spectra of the purified PPC圖2 （A－C）分別為30%－50%、50%－60%和60%－80%硫酸銨鹽析分離組分的吸收光譜（上欄）和相應的DEAE-52陰離子交換層析洗脫曲線（下欄）。（D）為各DEAE－52洗脫組分的吸收光譜

圖2為增溶上清經30%－80%飽和硫酸銨分級分離所得各鹽析組分的吸收光譜。30%－50%鹽析組分的特征吸收峰位于～276、380、450、480、511、590、690、760、798和848 nm，其中276 nm為蛋白質吸收峰，450、480和511 nm為球形烯Car吸收峰，380和590 nm分別為BChl a soret和Qx特征峰，760 nm為光反應中心脫鎂細菌葉綠素a的Qy特征峰，798和848 nm為BChl a的Qy特征峰，光反應中心的特殊對BChl a、輔助BChl a和LH2 BChl a的Qy特征峰均位于此處。結果表明30%－50%鹽析組分為RC和LH2的混合物。50%－60%鹽析組分與前者相比，少了690 nm BChl a特征峰和760 nm脫鎂細菌葉綠素a特征峰，表明該鹽析組分中主要是LH2。與前面兩者相比，60%－80%鹽析組分中，Car吸收峰發(fā)生了變化，BChl a Qy特征峰表明該分離組分以LH2為主。綜上所述，硫酸銨分級分離對PPC起到了初步分離的作用。

將各分離組分進行DEAE－52柱層析，對應洗脫曲線見圖2 30%－50%鹽析組分在0.1～0.15 mol L、0.15～0.2 mol／L和0.2～0.25 mol／L NaCl梯度下獲得3個洗脫組分，分別命名為P1、P2和P3。50%－60%鹽析組分在0.15～0.2 mol／L NaCl梯度下獲得P4洗脫組分。60%－80%鹽析組分在0.15～0.2 mol／L NaCl梯度下獲得P5洗脫組分。

增溶上清在蔗糖密度梯度中明顯分為2個條帶，分別位于20%－30%蔗糖層和50%－60%蔗糖層。20%－30%蔗糖層PPC組分的特征吸收峰主要位于271、380、450、480、511、590、798和848 nm（圖3A），而50%－60%蔗糖層PPC組分的特征吸收峰與前者明顯的差異在于出現690和760 nm吸收峰（圖3B）。將粗分離組分進行DEAE-52柱層析，洗脫曲線見圖3。20%－30%蔗糖層PPC組分在0.15～0.2 mol／L NaCl梯度下獲得P6洗脫組分。50%－60%蔗糖層PPC組分在0.15～0.2和0.2～0.25 mol／LNaCl梯度下分別獲得P7和P8洗脫組分。

Fig.3 （A）and（B）absorption spectra of the PPC components distributed on sucrose density gradient（up side）and elution profile during DEAE-52 ion-exchange chromatography（down side）.（C）absorption spectra of the purified PPC圖3 （A）和（B）分別為20%－30%和50%－60%蔗糖層中PPC組分的吸收光譜（上欄）和相應的DEAE－52陰離子交換層析洗脫曲線（下欄）。（C）為各DEAE－52分離組分的吸收光譜

2.3 純化組分的回收率

用吸收光譜檢測分離純化過程中蛋白質和PPC特征吸收峰的變化，分別以OD270和OD850表示總蛋白和PPC的相對含量，計算分離過程中各純化PPC組分的回收率，結果見表1和表2。結果表明，30%－50%、50%－60%和60%－80%鹽析組分分別約占PPC總量的36.7%、5.5%和21.3%。經DEAE離子交換層析獲得的5個PPC組分中P2和P5是優(yōu)勢組分，P1相對含量最少（表1）。增溶上清經蔗糖密度梯度離心處理，位于20%－30%蔗糖層和50%－60%蔗糖層的PPC組分分別約占PPC總量的62.6%和29.5%。與硫酸銨鹽析不同，經DEAE離子交換層析后可獲得P6、P7、P8 3個PPC組分，其中P6是優(yōu)勢組分，P8相對含量最少（表2）。

表1 硫酸銨鹽析結合離子交換層析分離純化PPC各組分的回收率Table 1 Recovery of protein and PPC during purification process by combination ammonium sulfate fractionation with ion exchange chromatography

2.4 純化PPC的光譜特征

圖2D和3C分別顯示了兩種分離方法制備的PPC的吸收光譜，P2、P4、P5、P6和P7具有典型的BChl 380 nm Soret帶、590 nm Qx帶、798和848 nm Qy帶吸收峰，以及典型的451、479和511 nm球形烯系Car吸收峰，與文獻中［13］報道的典型LH 2吸收光譜相似。P1在423nm具有一個額外的吸收峰，為不同于P2的LH2。P2、P4、P5、P6和P7洗脫組分的LH2中A798／A848比值分別為0.54、0.72、0.77、0.63和0.64，表明硫酸銨鹽析獲得3種不同光譜類型的LH2。蔗糖密度梯度離心獲得的P6和P7組分為光譜特征類似的LH2。P3和P8不同于LH2，其近紅外區(qū)呈現760、800和853 nm三指峰特征，另外還有380和600 nm BChla吸收峰，448、475和508 nm Car吸收峰，表明P3和P8為RC復合體，但峰位與文獻報道有細微差別［14－15］，可能由菌株差異造成。RC吸收光譜中蛋白質吸光度要明顯強于BChla，因此，表1和2顯示30%－50%鹽析組分和50%－60%蔗糖密度層中PPC純化倍數較低是由于含有RC所致。

表2 蔗糖密度梯度離心結合離子交換層析分離純化PPC各組分的回收率Table 2 Recovery of protein and PPC during purification process by combination sucrose densitygradient centrifugation with ion exchange chromatography

3 討論

蔗糖密度梯度離心結合離子交換層析法可以獲得2種類型的色素蛋白復合體，RC（P8）和1種LH2（P6和P7，A798／A848約為0.63），相對含量分別為57.1%和2.5%。而硫酸銨鹽析結合離子交換層析法除了RC外，分離到3種具有不同 A798／A848比值的 LH2，A798／A848分別為0.54（P2）、0.72（P4）和0.77（P5），其中P2為優(yōu)勢組分。而且還能夠富集分離到1種具有423 nm吸收峰的LH2（P1），約占PPC總量的0.9%。

大量研究表明，LH2特征光譜差異多與αβ的不同相關。在Rps.palustris、Allochromatiumvinosum和Phaeospirillummolischianum等菌株中，不同多拷貝pucBA表達的αβ多肽結合形成LH2，導致產生不同光譜類型的LH2［7，16，8］。雖然固氮紅細菌的全基因組尚未測序，本文分離到不同光譜類型LH2表明該菌株基因組中存在多個編碼LH2αβ多肽的基因（pucBA）。

根據吸收光譜判斷分級分離起到了粗分離效果，分別將3個鹽析組分經DEAE－52陰離子交換層析，于相同的NaCl梯度（0.15～0.2 mol／L）獲得3種不同光譜特征的LH2，其特征吸收峰均在798和848 nm，而其相對強度存在差異，這種差異和各自鹽析組分的特征光譜對應。鹽析方法與被分離蛋白質的表面電荷相關，由此推斷，P2、P4和P5 3種LH2存在表面電荷差異，用硫酸銨分級分離可以將其分離。另外，鹽析適用于大量樣品的處理，因此本文從固氮紅細菌中分離到含量較低的具有423 nm吸收峰的LH2（P1）。蔗糖密度梯度離心主要是憑借重力或離心力場的作用，將PPC按比重分層分離，在50%－60%蔗糖層也分離到LH2，是由于部分LH2隨著RC沉降。DEAE－52進一步層析蔗糖密度梯度離心后分離組分只獲得1種光譜類型LH2。綜合2種分離純化結果，P2、P4和P5 3種LH2比重相近，蔗糖密度梯度離心結合DEAE離子交換層析沒有將其分離，只獲得一種光譜類型的LH2。目前不同多拷貝puc基因表達的LH2性質非常相似，因此，將其分離仍是難點。本文通過設置硫酸銨鹽析梯度，從而實現了對不同光譜類型LH2的分離。

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