王蕾，張顯文，田保華，薛紹武＊

（1.山西大學 分子科學研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006；

2.華中農(nóng)業(yè)大學 生命科學技術學院，湖北 武漢 430070；3.山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006）

植物通過氣孔吸收CO2進行光合作用，同時由于蒸騰作用不可避免的散失水分。植物可以根據(jù)外界環(huán)境條件調節(jié)氣孔開度大小來調控水分的散失，同時又保證足夠CO2的吸收 保衛(wèi)細胞離子跨膜運輸和有機溶質含量的變化引起保衛(wèi)細胞膨壓和體積的變化，氣孔開度也會隨之變化［2］。細胞質鈣離子（Ca2＋）被公認為是植物應對各種脅迫刺激時重要的第二信使，它在植物細胞信號轉導過程中起著重要作用［3］。一般認為，細胞響應眾多外界脅迫刺激時主要是通過細胞質游離Ca2＋濃度（［Ca2＋］cyt）變化來調控，當受到外界刺激時，細胞外Ca2＋的流入以及細胞內(nèi)鈣庫的釋放，引起［Ca2＋］cyt的升高，繼而激活可以與Ca2＋結合的蛋白質或酶，從而引起細胞反應。在保衛(wèi)細胞中，［Ca2＋］cyt可以調控保衛(wèi)細胞離子通道和質子泵的活性。［Ca2＋］cyt升高可以激活S－型陰離子通道和外向整流鉀（）通道，從而調控氣孔運動［4－5］。

鈣依賴性蛋白激酶（calcium dependent protein kinase，CDPK），屬于Ser／Thr型蛋白激酶，分子量40～90 k Da，它有3個主要的功能區(qū)，其中一個是類似于Ca M的調節(jié)區(qū)，包含4個EF手型結構，可以結合4個Ca2＋［6］。CDPK與Ca2＋結合后，酶隨即被激活，從而引起下游反應。CDPK作為鈣感受器在植物體內(nèi)分布廣泛，在植物生長發(fā)育調控及植物應對生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用［7］；在眾多激素信號網(wǎng)絡中，CDPK也是重要的調節(jié)因子［8］。擬南芥中有34個CDPK成員，CPK6和CPK3屬于CDPK家族的成員［9］。擬南芥CPK 6基因位于第二條染色體上。Xu等研究表明，擬南芥（Arabidopsis thaliana）體內(nèi)過表達CPK6后，響應鹽脅迫和干旱脅迫時，植物體內(nèi)的丙二醛含量低于野生型，脯氨酸的含量高于野生型，植株的抗旱、耐鹽脅迫的能力明顯提高，表明CPK6在應對鹽脅迫和干旱脅迫過程中起正調控作用。在脫落酸（ABA）和茉莉酸甲酯（MJ）誘導擬南芥氣孔關閉過程中，CPK6對陰離子通道和Ca2＋通透的非選擇性陽離子通道（ICa）起著正調控作用［9－10］。同時，Ye等［11］研究表明CPK6參與了酵母誘導子（YEL）誘導的氣孔關閉過程。這些結果說明CPK6是植物響應生物和非生物脅迫誘導氣孔關閉信號通路中的重要信號分子。擬南芥CPK 3位于第四條染色體上。CPK3也參與了ABA誘導氣孔關閉過程中，可以使Ca2＋激活的質膜S型陰離子通道蛋白磷酸化［12］。但是CPK3在MJ和YEL誘導的氣孔關閉中不發(fā)揮作用，CPK3可能只在干旱誘導的氣孔關閉過程中起作用，在應對生物脅迫中不起作用［12］。CPK6和CPK3參與了眾多信號分子通路中，在CO2信號通路中有何作用目前尚不清楚。本研究通過PCR技術建立了鑒定鈣依賴性蛋白激酶T-DNA插入突變體的快捷方法，并在此基礎上，研究了CPK6與CPK3是否參與到CO2的信號過程中，為進一步研究CDPKs的功能提供一些線索。

1 材料與方法

1.1 植物材料及其培養(yǎng)條件

擬南 芥 野 生 型 （Columbia-0，col-0），T-DNA 插 入 突 變 體cpk3-1（SALK-107620）、cpk6-1（SALK-093308）種子購自美國俄亥俄州立大學 Arabidopsis Biological Resource Center（ABRC）。種子先用體積分數(shù)70%的酒精加入體積系數(shù)0.1%Triton X-100消毒處理，然后將滅菌處理的種子種在盛有1／2 MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在冰箱4℃春化2 d后轉移到人工氣候培養(yǎng)箱中，在培養(yǎng)基中生長10 d左右再轉移到土中放入生長箱培養(yǎng)。生長環(huán)境條件為（22±1）℃，16 h光照／8 h黑暗，相對濕度70%－90%。

1.2 主要試劑

DNA Marker購自北京全式金生物技術有限公司，2×Taq Master Mix、DEPC、Tris等DNA和RNA提取試劑為上海生物工程公司產(chǎn)品，Taq DNA Polymerase，Real-time PCR試劑盒購自 To KaRa公司，R Nasefree DNaseⅠ購自 Thermo Scientific公司，MLV逆轉錄酶購自Promega公司，Trizol reagent RNA 提取試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 單株植物總DNA的提取

將擬南芥植株單株編號，參照并改良Edwards等［13］的方法，將DNA extraction buffer＋Nuclei lysis buffer＋5%sarkosyl（三者比例為1∶1∶0.4）＋0.02 mol／L的NaHSO3，混勻作為緩沖液混合物，65℃溫育并不斷搖晃，直至清亮透明。剪取4－5周大小的擬南芥葉1－2片于1.5 mL離心管中，加入200μL緩沖液混合物，用電鉆將葉片打碎后再加500μL緩沖液混合物。將打碎的葉片組織65℃溫育40～60 min，1次／10 min，輕輕顛倒混勻。加入750μL氯仿＋異戊醇（24∶1），混勻。10℃條件下，12 000 r／min離心8 min。轉移上清至一新的1.5 mL離心管中，加2／3－1體積的冷異丙醇，輕輕顛倒混勻。－20℃靜置30 min，10℃下，12 000 r／min離心10 min棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀。再在10℃下，12 000 r min離心2 min棄上清。在超凈臺中風干，并加入滅菌的dd H2O溶解DNA。4℃溶解后，－20℃保存作為PCR擴增的DNA模板。

1.4 PCR擴增體系

采用三引物PCR法，以提取的單株植物總DNA為模板，進行PCR擴增。

PCR擴增反應體系：模板DNA 2μL、2×Taq Master Mix 10μL、0.1 mmol／L引物2μL加dd H2O補足20μL。PCR反應條件：94℃預變性3 min；94℃ 變性30 s，58.8℃退火30 s，72℃ 延伸1 min，40個循環(huán)；最后72℃ 延伸7 min，4℃保存。

純合植株獲得基因型鑒定所用的引物序列分別為：Salk＿LBb1.3：（LB1.3）5’-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3’；cpk3-1：（P31）5’-CTCGTTCCACCACATCTAC-3’（P32）5’-AATTCCCCTCCTTCACACA-3’；cpk6-1：（P63）5’-CCGCGTAAAAGACCTTTCTTC-3’（P64）5’-AGCATAGTCAACACCTGTGGC-3’。

1.5 總RNA的提取和RT-PCR

液氮研磨組織葉片，每個1.5 m L樣品管分裝0.1 g組織樣品；每管加入1 m L Trizol試劑，迅速混勻；室溫下靜置5 min；加入200μL的氯仿，劇烈震蕩搖晃15 s，室溫下靜置5 min左右；12 000 r／min離心10 min；將上清轉移到新離心管中，加0.5 m L異丙醇，混勻，－20℃下沉淀10 min；12 000 r／min離心15 min；棄去上清，加1 m L 75%乙醇清洗RNA，振蕩片刻后，7 500 r／min離心5 min，小心棄上清；可重復此操作，確保沉淀中的乙醇被清洗干凈，室溫靜置5～15 min，使RNA沉淀恰好干燥，加入20μL DEPC水溶解RNA，取2μL瓊脂糖電泳檢測RNA質量與濃度，將剩余RNA保存于－20℃冰箱中備用。

反轉錄過程和RT-PCR過程的操作均參照標準方法［14］。

反轉錄后進行基因表達量檢測的引物序列分別為：TPC1：（PP01）5’-TTTGTTGATGTGCTGGTTGA-3’（PP02）5’-TAGAGCACGAAGAACACCGA-3’；ACA9：（PP03）5’-TTCATTCACTGGAAGGGAGC-3’（PP04）5’-CCAGTCACCATTCGTACCTT-3’；ACA11：（PP05）5’-ACCTACAGAAAGGGCGATAC-3’（PP06）5’-TGTAGCCACCATTAGGAAGA-3’；CAX1：（PP07）5’-TGACACTCGTTATCGCATTG-3’（PP08）5’-TATGGGTGTTGTATGCCTCA-3’；SLAC1：（PP09）5’-ATTCCACTTTCGCCGACATC-3’（PP10）5’-CTAGGGCAAGCCACAAGACA-3’；MRP5：（PP11）5’-CGCCGCAGTTACATTCGCTAC-3’（PP12）5’-ATTTGCCCAAGCCATCCACC-3’；AKT1：（PP13）5’-ACTACTTTTGGGTCCGATGC-3’（PP14）5’-TTGGGAGTGCATCAAGAGTT-3’；AKT2：（PP15）5’-GCTTCTTGTCCGTGAACCTA-3’（PP16）5’-GTAAGCAGTGAGGCCAAGAT-3’；KAT1：（PP17）5’-GAACCAGAACCTTTAGGGATT-3’（PP18）5’-TTCCAGCGGTTTCACTACTT-3’；KC1：（PP19）5’-TCGTGTAGCCGAACTCTTTA-3’（PP20）5’-GGAGCGGAATAGATGTTGGT-3’；KCO1：（PP21）5’-CACCTCCTCATCCGAGTAAA-3’（PP22）5’-AAGCTGAGATAACCGGCATT-3’；SKOR：（PP23）5’-ATGGCAACTGTTGGTTATGG-3’（PP24）5’-CCAATACACCGTGACAAACA-3’；GORK：（PP25）5’-GGAGTGATTGGTTTGCTTGT-3’（PP26）5’-TCGCAGCGGTTACTATGAGT-3’；ACTIN7：（PP27）5’-GGCCGATGGTGAGGATATTCAGCCACTTG-3’（PP28）5’-TCGATGGACCTGACTCATCGTACTCACTC-3’。

1.6 全葉片氣孔導度的測定

取生長4周左右的植株，用光合分析儀（Li6400）對植物葉片進行氣孔導度的測定，每1編號最少測3株幼苗，每個編號至少測3株野生型（Col）的植株作為對照，每株植株測1片葉。分別用不同CO2濃度處理每個葉片：400μL／L 0.5 h，800μL／L 1 h，100μL／L 0.5 h，對所得數(shù)據(jù)進行分析作圖。

1.7 CO2對離子通道編碼基因表達量的影響

分別選取400μL／L和800μL／L CO2環(huán)境下生長的野生型植株和突變體cpk6-1、cpk3-1、cpk3-1／6-1植株葉片，提取總RNA，進行反轉錄，對四種材料中與離子通道相關的編碼基因的表達量進行檢測。

2 結果與分析

2.1 CDPK功能缺失突變體cpk6-1、cpk3-1以及cpk3-1／6-1純合株的鑒定

cpk6-1 T-DNA片段插入點在第二個外顯子上，在翻譯起始密碼子下游60個堿基對的位置，cpk3-1 T-DNA片段插入點在第一個外顯子上 圖1A 當用引物組合LP＋RP進行PCR檢測時，野生型植株（Col）目的基因的兩條染色體上都沒有T-DNA片段的插入，所以只有一條PCR產(chǎn)物帶；雜合體植株（heterozygous lines，HZ）目的基因的兩條染色體上有一條發(fā)生了T-DNA插入突變，所以也會產(chǎn)生一條分子量大小與LP＋RP擴出的條帶分子量相同的產(chǎn)物帶；而純合體植株（homozygous lines，HM）目的基因的兩條染色體上都有T-DNA片段的插入，所以沒有產(chǎn)物帶產(chǎn)生。同理，當用LB1.3＋RP進行PCR檢測時，野生型植株沒有產(chǎn)物帶產(chǎn)生，而雜合體植株與純合體植株都有一條分子量大小相同的產(chǎn)物帶（圖1B）。綜合兩種引物對組合檢測結果，鑒定獲得純合體植株。

Fig.1 T-DNA insertion sites of cpk6-1 and cpk3-1（A）as well as detection with PCR （B）圖1 cpk6-1和cpk3-1 T-DNA插入位點以及PCR檢測結果

Fig.2 Compare the stomatal conductance of mutants cpk6-1、cpk3-1 and cpk3-1／6-1 with col wild-type plant under different CO2 treatment圖2 不同濃度CO2 處理野生型（Col）與突變體cpk6-1、cpk3-1以及cpk3-1／6-1氣孔導度變化

2.2 不同濃度CO2 處理突變體cpk6-1、cpk3-1以及cpk3-1／6-1氣孔導度變化

為了觀察CDPK是否參與CO2的信號過程，我們測定了突變體cpk6-1、cpk3-1以及cpk3-1／6-1在不同濃度CO2處理下的氣孔導度變化。從圖2中可以看出，野生型對照組與突變體測得的氣孔導度曲線軌跡相似，說明在響應不同濃度的CO2時，野生型和突變體cpk3-1、cpk6-1以及cpk3-1／6-1之間沒有明顯差異（P＝0.282（cpk3-1）；0.061 2（cpk6-1）；0.125（cpk3-1／6-1））。

2.3 CO2對離子通道編碼基因表達量的影響

已有研究表明［15］，高濃度CO2處理保衛(wèi)細胞可以激活陰離子通道電流。在此我們研究了野生型植物和突變體cpk6-1、cpk3-1以及cpk3-1／6-1在不同濃度CO2處理下，離子通道表達量的變化。在野生型和三種突變體中，內(nèi)向整流K＋通道（K＋in）編碼基因KAT1、AKT1、AKT2以及陰離子通道SLAC1與其調節(jié)因子編碼基因MRP5，外向整流K＋通道（K＋out）編碼基因GORK、KCO1，只有在不同CO2濃度處理后基因表達量表現(xiàn)出差異；相同CO2濃度處理條件下野生型和突變體之間沒有明顯差異。說明不同濃度CO2處理影響了KAT1、AKT1、AKT2、SLAC1、MRP5、GORK、KCO1的表達量，然而CPK3和CPK6可能沒有參與CO2對上述通道基因的表達（圖3A）。

Ca2＋通道的編碼基因TPC1，Ca2＋-ATPase編碼基因及Ca2＋－H＋的反向轉運蛋白編碼基因ACA9、ACA11及CAX1 Kin通道編碼基因中KCl及Kout通道編碼基因中SKOR 在不同CO2濃度處理前后，野生型和突變體的表達量都沒有表現(xiàn)出差異。說明TPC1、Ca2＋-ATPase、ACA9、ACA11、CAX1、KC1、SKOR的表達量不受CO2的影響，CPK3和CPK6對這些基因的表達也沒有影響（圖3B）。圖4表示在400μL／L和800μL／L CO2生長條件下野生型和突變體cpk6-1、cpk3-1、cpk3-1／6-1植物離子通道相關基因的表達量的變化。結論與圖3一致。

Fig.3 Effect of CO2 on expression of ion channel-related genes Expression of potassium channel-related genes（A），anion channel-and calcium channel-related genes（B）affected by normal and high CO2 in the mutants and wild-type plants圖3 CO2對離子通道編碼基因表達量的影響

Fig.4 Relative expression level of ion channel-related genes under treatment with normal（N：400μL／L）and high（H：800μL／L）CO2圖4 不同濃度CO2對離子通道相關編碼基因表達量的影響（圖中數(shù)據(jù)來自圖3數(shù)據(jù)的分析。N：400μL／L CO2，H：800μL／L CO2）

3 討論

人們很早就認識到低濃度CO2誘導氣孔開放，高濃度CO2誘導氣孔關閉，但是直到近些年來才逐漸發(fā)現(xiàn)參與CO2調控氣孔運動的基因。發(fā)現(xiàn)參與CO2調控氣孔運動的基因是H T 1（HIGH LEAF TEMPERATURE 1），它編碼一種蛋白激酶。在功能缺失的突變體ht1中，葉片氣孔對CO2反應超敏感，表明HT1是CO2信號中負調控因子 Hu等 研究發(fā)現(xiàn)，碳酸酐酶CA1和CA4是高濃度CO2誘導氣孔關閉過程中的上游調節(jié)因子。CPK3和CPK6在激素ABA誘導氣孔關閉過程中起著重要調節(jié)作用［9］。本實驗通過測定葉片氣孔導度應對不同濃度CO2的變化，沒有發(fā)現(xiàn)CPK3和CPK6參與調節(jié)高濃度CO2誘導氣孔關閉過程。

當植物受到生物和非生物刺激時，植物細胞能夠感受這些刺激并做出響應，多數(shù)可以通過細胞質中游離Ca2＋濃度變化傳遞信號。氣孔運動主要由保衛(wèi)細胞膨壓變化控制的，保衛(wèi)細胞質膜上離子通道的活動控制著膨壓的變化［2］。保衛(wèi)細胞通道電流、陰離子通道電流都受到胞質Ca2＋的調控［17－18］。當保衛(wèi)細胞受到高濃度CO2和碳酸氫根誘導后，胞質Ca2＋升高，激活慢型陰離子通道，誘導氣孔關閉［18－19］。在氣孔開放過程中，質膜H＋-ATPases能夠將細胞內(nèi)的H＋泵至胞外，質膜超極化所產(chǎn)生的電化學梯度作為動力驅動K＋、Cl－、NO3－和 Malate2－進入胞內(nèi)，使保衛(wèi)細胞的膨壓升高，氣孔開放［20，21］。然而，低濃度CO2誘導氣孔開放的機制目前還不清楚。由于離子通道的活動與氣孔運動關系密切，因此研究了不同濃度CO2生長條件下植物離子通道的轉錄表達水平，并且試圖解析CPK3和CPK6是否影響CO2對離子通道的轉錄表達。本實驗發(fā)現(xiàn)不同濃度的CO2處理植物在轉錄水平影響了離子通道相關基因的表達，然而CPK3和CPK6沒有參與該過程。

擬南芥中CDPKs家族有34個成員，研究其他成員的功能是未來需要探討的課題。

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