何 勝 曾維政

胃癌是我國發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤，流行病學(xué)研究顯示其發(fā)病與遺傳因素、環(huán)境因素以及幽門螺桿菌感染等多種因素有關(guān)，其發(fā)生與演變與多基因變異密切相關(guān)，且為多種基因共同作用的結(jié)果[1]。Bmi-1 基因（B cell-specific MLV integration site-1）作為多梳基因家族的成員，可與c-myc異位基因共同作用引起胃腸道腫瘤的形成和轉(zhuǎn)化，在胃腸道腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但Bmi-1基因的表達(dá)與胃癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系尚不明確[2]。為此，本研究針對胃癌組織中Bmi-1基因表達(dá)與胃癌分化、轉(zhuǎn)移及臨床預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了研究。

資料和方法

一、一般資料

選取我科2013年1月至2014年1月行胃癌根治術(shù)患者72例的術(shù)后標(biāo)本、術(shù)后病理蠟塊及完整臨床資料，所有患者均經(jīng)術(shù)后病理確診為胃癌，所有蠟塊均包括腫瘤組織和癌旁組織（病理學(xué)確診的正常組織，距離腫瘤邊緣5～10 cm）。排除術(shù)前已經(jīng)接受放療、化療的患者。切取標(biāo)本后，以液氮冷凍，置入-80℃冰箱備用。男性45例，女性27例；年齡32～80歲，平均年齡（55.8±3.4）歲。患者具體一般資料，見表1。

二、實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

RT-PCR試劑盒購自上海申能博彩生物科技有限公司，Bmi-1引物和GAPDH引物購自大連寶生物工程有限公司，鼠抗人Bmi-1單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

PCR擴(kuò)增儀購自Thermo Hybaid公司，紫外分光光度計(jì)購自日本島津公司，低溫高速離心機(jī)購自德國Eppendorf公司，BX-50全自動(dòng)顯微照相系統(tǒng)購自日本OLYMPUS公司，EG1160全自動(dòng)包埋機(jī)和RMZ145半自動(dòng)切片機(jī)購自德國LELCA公司，電熱恒溫水浴箱購自上海醫(yī)療器械七廠。

三、實(shí)驗(yàn)方法

采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)測定胃癌組織及癌旁組織Bmi-1基因mRNA表達(dá)。將處于對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞進(jìn)行處理后加入TRIzol 1 mL抽提細(xì)胞RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒上的操作說明合成cDNA，采用GeneAmp9600型PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。HPV 16E6 mRNA的反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃4 min，變性94℃30 s，退火54℃30 s，延伸72℃1 min，最后延伸10 min，一共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物置于1.5%的瓊脂凝膠電泳中進(jìn)行檢測。

表1 胃癌組織Bmi-1 mRNA表達(dá)和胃癌各臨床及病理因素之間的關(guān)系 [n（%）]

采用免疫組化對石蠟切片染色檢測胃癌組織及癌旁組織Bmi-1蛋白表達(dá)水平?；颊咝g(shù)后留取少量胃癌組織及癌旁組織制成石蠟切片送病理檢驗(yàn)。將胃癌組織及癌旁組織樣本用10%的甲醛進(jìn)行固定，并用石蠟進(jìn)行包埋后切片，平均片厚約2 μm，臘片脫蠟后采用3%的雙氧水在室溫下孵育5～10 min后，進(jìn)而將內(nèi)源性的過氧化氫酶活性清除。蒸餾水清洗3次后置入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行浸泡，5 min后置于95℃的環(huán)境下，15 min后降至室溫進(jìn)行冷卻。將新配制的二氨基聯(lián)苯胺溶液滴于切片上，顯色3 min后置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，蒸餾水充分沖洗后使用蘇木紫進(jìn)行再次染色，脫水后封片。

四、觀察指標(biāo)

1.PCR結(jié)果

采用 （100 V，10 min）1%瓊脂糖凝膠對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳之后，溴化乙錠染色，分析結(jié)果采用凝膠成像分析系統(tǒng)，同時(shí)拍照。對比胃癌組織及癌旁組織的PCR結(jié)果。

2.免疫組化結(jié)果

免疫組化中，陽性表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)中棕黃色或黃色顆粒。其中染色程度：1分，不著色；2分，淡黃色；3分，棕黃色；4分，棕褐色。染色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率：1分， <10%；2分，10% ～50%；3分，51% ～75%；4分，>75%。染色程度和染色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率相乘乘積進(jìn)行計(jì)算：1～4分，陰性；5～8分，弱陽性；9～12分，中等陽性；13～16分，強(qiáng)陽性。對比不同臨床分期的胃癌組織及癌旁組織的免疫組化結(jié)果。

3.胃癌組織Bmi-1 mRNA表達(dá)和胃癌各臨床及病理因素之間的關(guān)系

記錄所有患者的性別、年齡、臨床分期、Borrmann分型、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。臨床分期采用胃癌TNM分期法（2002年抗癌國際聯(lián)盟）。

4.隨訪

對于所有患者進(jìn)行為期1年的術(shù)后隨訪，方式為電話和門診隨訪，記錄胃癌組織Bmi-1 mRNA表達(dá)陽性和陰性兩組患者術(shù)后1年復(fù)發(fā)率和死亡率。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、胃癌組織及癌旁組織的PCR結(jié)果

從圖1可見，胃癌組織中的Bmi-1基因mRNA表達(dá)顯著高于癌旁組織。Bmi-1基因mRNA在胃癌組織中呈強(qiáng)表達(dá)，在癌旁組織中呈弱表達(dá)。

圖1 胃癌組織及癌旁組織的PCR結(jié)果對比

二、胃癌組織及癌旁組織的免疫組化結(jié)果

胃癌組織及癌旁組織的免疫組化結(jié)果對比，見表2、圖2。圖2中，Bmi-1蛋白在癌旁組織中缺乏陽性表達(dá)，在胃癌組織中表達(dá)集中于腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核中，表現(xiàn)為棕黃色或棕褐色顆粒。表2中，胃癌組織中的Bmi-1蛋白陽性表達(dá)率顯著高于同期癌旁組織，Ⅲ-Ⅳ期胃癌組織的Bmi-1蛋白陽性表達(dá)率顯著高于Ⅰ-Ⅱ期胃癌組織，P<0.05。

表2 胃癌組織及癌旁組織的免疫組化結(jié)果對比 [n（%）]

圖2 胃癌組織及癌旁組織的免疫組化結(jié)果對比（SP，×200）。A：胃癌組織（Ⅲ期）中癌細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)可見較多棕黃色或棕褐色顆粒；B：胃癌癌旁組織中（Ⅲ期）細(xì)胞核染色呈藍(lán)色。

三、胃癌組織Bmi-1 mRNA表達(dá)與臨床及病理因素之間的關(guān)系

胃癌組織Bmi-1 mRNA表達(dá)和胃癌各臨床及病理因素之間的關(guān)系，見表1。低分化、Borrmann分型Ⅲ-Ⅳ型、臨床分期Ⅲ-Ⅳ期、浸潤深度T3-T4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的胃癌組織Bmi-1 mRNA表達(dá)陽性率顯著升高，P<0.05。

四、胃癌組織Bmi-1 mRNA表達(dá)和術(shù)后1年復(fù)發(fā)率及死亡率的關(guān)系

胃癌組織Bmi-1 mRNA表達(dá)和術(shù)后1年復(fù)發(fā)率及死亡率的關(guān)系，見表3。胃癌組織Bmi-1 mRNA表達(dá)陽性患者術(shù)后1年復(fù)發(fā)率顯著高于陰性患者，P<0.05。

表3 胃癌組織Bmi-1 mRNA表達(dá)和術(shù)后1年復(fù)發(fā)率及死亡率的關(guān)系 [n（%）]

討 論

近年來的研究表明，Bmi-1基因在許多實(shí)體瘤，包括肺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、乳腺癌、鼻咽癌以及胃癌等腫瘤中均有較高的表達(dá)水平，提示Bmi-1基因的高表達(dá)在腫瘤發(fā)生與演變的過程中起著重要作用[3]。胃癌作為我國發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤，其流行病學(xué)研究顯示其發(fā)病與遺傳因素、環(huán)境因素以及幽門螺桿菌感染等多種因素有關(guān)，其發(fā)生和演變與多基因變異密切相關(guān)，且為多種基因共同作用的結(jié)果。Bmi-1基因作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，可以介導(dǎo)鄰近基因沉默，并在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控細(xì)胞的衰老及增殖，進(jìn)而引起一系列細(xì)胞生物學(xué)改變[4]。Bmi-1的家族成員主要包括Mel-18以及BLG等一系列保守且重要的蛋白質(zhì)，Bmi-1基因主要存在于人類基因的10號染色體短臂13區(qū)，開放的閱讀框編碼蛋白含有326個(gè)氨基酸，其主要包含一個(gè)位于N末端的環(huán)指結(jié)構(gòu)區(qū)域以及一個(gè)位于中心保守DNA結(jié)合模序的結(jié)構(gòu)區(qū)域，正是這兩個(gè)區(qū)域在細(xì)胞的分化以及腫瘤形成過程中起到重要作用[5-6]。Bickenbach等[7]研究顯示，Bmi-1基因與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在轉(zhuǎn)基因鼠的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高水平表達(dá)的Bmi-1基因可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞瘤的發(fā)生，而Bmi-1基因的表達(dá)缺失則會(huì)阻滯淋巴細(xì)胞的功能[8]。

本研究采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) （RTPCR）技術(shù)測定胃癌組織及癌旁組織Bmi-1基因mRNA表達(dá)，以證實(shí)胃癌組織中是否存在Bmi-1基因mRNA的高表達(dá)；同時(shí)采用免疫組化對石蠟切片染色檢測胃癌組織及癌旁組織Bmi-1蛋白表達(dá)水平，旨在觀察胃癌組織中是否存在Bmi-1蛋白的表達(dá)。分析胃癌組織Bmi-1 mRNA表達(dá)和胃癌各臨床及病理因素之間的關(guān)系，對比mRNA表達(dá)陽性和陰性兩組患者的術(shù)后1年復(fù)發(fā)率和死亡率。本研究顯示，胃癌組織中的Bmi-1基因mRNA表達(dá)顯著高于癌旁組織，且Bmi-1基因mRNA在胃癌組織中呈強(qiáng)表達(dá)，在癌旁組織中呈弱表達(dá)，胃癌組織中的Bmi-1蛋白陽性表達(dá)率顯著高于同期癌旁組織。結(jié)果提示，Bmi-1高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖及浸潤有關(guān)，而腫瘤細(xì)胞的過度增殖會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的浸潤及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，且這種高表達(dá)水平不僅存在于轉(zhuǎn)錄水平，且在轉(zhuǎn)錄后也呈表達(dá)水平上調(diào)狀態(tài)，因此Bmi-1是一種腫瘤的異常分子標(biāo)志物[9]。Bmi-1還可以通過誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的端粒酶活性進(jìn)而促進(jìn)其增殖，并參與胃癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[10]。另外，本研究結(jié)果中Ⅲ-Ⅳ期胃癌組織的Bmi-1蛋白陽性表達(dá)率顯著高于Ⅰ-Ⅱ期胃癌組織。低分化、Borrmann分型Ⅲ-Ⅳ型、臨床分期Ⅲ-Ⅳ期、浸潤深度T3-T4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的胃癌組織Bmi-1 mRNA表達(dá)陽性率顯著升高。即Borrmann分型越晚、浸潤程度越深、腫瘤較大同時(shí)伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，其Bmi-1基因表達(dá)水平越高。提示，Bmi-1基因在胃癌的分化以及癌細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移潛能的過程中起到重要作用，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)展[11]。在預(yù)后方面，臨床分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的兩個(gè)重要因素[12]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織Bmi-1 mRNA表達(dá)陽性患者術(shù)后1年復(fù)發(fā)率顯著高于陰性患者。提示，胃癌組織中的Bmi-1基因表達(dá)與胃癌預(yù)后有關(guān)，可能成為檢測胃癌患者病情以及評估胃癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。

綜上所述，癌組織中Bmi-1對于胃癌分化、轉(zhuǎn)移及臨床預(yù)后具有一定的評價(jià)和預(yù)測作用，可能成為檢測胃癌患者病情以及評估胃癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。

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