李鴻利，韋 嘉，袁 媛，湯躍躍，李云燕，陸永萍

0 引 言

脂肪性肝病己成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝?。?］。脂肪肝會(huì)逐漸發(fā)展為脂肪性肝炎、肝纖維化，肝硬化并可能引起肝細(xì)胞癌變惡性事件發(fā)生［2］。因此，早期發(fā)現(xiàn)和診斷脂肪肝病變及病變程度是判斷病情、決定治療方案的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。肝組織活檢是診斷肝纖維化和肝硬化的金標(biāo)準(zhǔn)［3］，但該方法有創(chuàng)，對(duì)于肝病患者，尤其是脂肪肝患者，接受率低。超聲可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察脂肪肝從正常肝直至脂肪性肝硬化的動(dòng)態(tài)病變過程，還可準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)脂肪肝出現(xiàn)變化的時(shí)間點(diǎn)，且可重復(fù)性好、靈敏度高［4－6］。復(fù)制出與人類脂肪肝發(fā)病機(jī)制相仿的動(dòng)物模型，進(jìn)行超聲監(jiān)測(cè)及病理對(duì)照，可更好地研究脂肪肝的發(fā)展進(jìn)程，為及時(shí)干預(yù)、治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。本研究首先建立兔脂肪肝動(dòng)物模型，用超聲觀察并行病理切片對(duì)照，監(jiān)測(cè)兔脂肪肝發(fā)展情況，為深入研究脂肪肝肝纖維化發(fā)病機(jī)制提供動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 模型制備 選取健康雄性日本大耳白兔，40只(昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重1.00 ～1.52 kg，兔齡(17.01±1.54)d。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(滇)2011-0004。隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組20 只，實(shí)驗(yàn)組50°乙醇(紅星二鍋頭)強(qiáng)行灌胃，2 次/d，每次10 mL，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。對(duì)照組常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 超聲觀察 于喂養(yǎng)前，喂養(yǎng)12、16 和20 周共4次對(duì)兔脂肪肝程度進(jìn)行觀察。觀察前所有兔禁食8 ～12 h，采用Aixplorer 型超聲診斷儀(Supersonic Imagine公司，法國)ShearWaveTM實(shí)時(shí)剪切波彈性成像，L15-4 線陣探頭，頻率4 ～15 MHZ。將兔平躺固定于操作臺(tái)上，右4 肋至腹部備皮，充分暴露檢查區(qū)，行腹部及肝進(jìn)行的超聲觀察，包括肝大小、回聲、包膜情況，有無腹水等。對(duì)肝聲像圖征象進(jìn)行詳細(xì)記錄。

按照脂肪肝的診斷標(biāo)準(zhǔn)將脂肪肝分為輕、中、重度:①輕度即肝內(nèi)回聲增強(qiáng)，但能顯示肝內(nèi)血管邊界及膈肌;②中度即肝內(nèi)回聲中等度增強(qiáng)，肝內(nèi)管道或膈肌顯示輕度減弱;③重度即肝內(nèi)回聲明顯增強(qiáng)，肝內(nèi)管道、膈肌或肝右葉后部分顯示差或不能顯示［7］。

1.3 病理觀察 20 周超聲觀察后處死動(dòng)物，取出肝，稱量肝濕重(liver weight，LW)，觀察肝大小、形態(tài)、顏色、表面光滑度、葉間裂寬度、邊緣銳利度及切面情況［8］。同時(shí)留取10%甲醛固定標(biāo)本肝組織標(biāo)本，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(片厚4 ～6 μm)，分別進(jìn)行HE 及苦味酸(天狼星紅)染色。制備成病理切片，在顯微鏡下觀察。脂肪肝病理分級(jí)診斷標(biāo)準(zhǔn):正常，肝細(xì)胞脂肪變性＜5%;輕度，肝細(xì)胞脂肪變性為5%～33%;中度，肝細(xì)胞脂肪變性為34%～66%;重度，肝細(xì)胞脂肪變性＞66%［9－10］。肝纖維化分期:S0 期為無纖維化;S1 期為匯管區(qū)擴(kuò)大伴纖維增生;S2 期為匯管區(qū)周圍纖維化或纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留;S3 期為肝纖維化伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，未形成肝硬化;S4 期為重度纖維化或早期肝硬化［11］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩組均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，相關(guān)采用Pearson 線性相關(guān)或Spearman 等級(jí)相關(guān)。以P≤0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

動(dòng)物模型在制備飼養(yǎng)過程中，對(duì)照組分別在12及16 周各死亡1 只;實(shí)驗(yàn)組分別在12 周死亡2 只及16 周死亡1 只，死亡原因?yàn)楣辔笗r(shí)乙醇誤吸入氣管導(dǎo)致肺炎，以及乙醇中毒引起的中樞神經(jīng)抑制或肝衰竭。

2.1 一般情況 對(duì)照組:兔皮毛光滑，活動(dòng)靈活，進(jìn)食量與排便正常，體重穩(wěn)步逐增。實(shí)驗(yàn)組:兔皮毛漸粗糙失去光澤，兔灌胃后數(shù)10 min 內(nèi)出現(xiàn)困倦，活動(dòng)遲緩，部分酣睡，需2 ～3 h 后恢復(fù)，進(jìn)食減少，糞便稀，體重下降。對(duì)照組兔齡與體重進(jìn)行相關(guān)性分析，呈正相關(guān)(r=0.96，P ＜0.01);實(shí)驗(yàn)組兔齡與體重進(jìn)行相關(guān)性分析，呈正相關(guān)(r=0.87，P ＜0.01)。大鼠兔齡與體重的關(guān)系見表1。

表1 各組兔齡與體重的關(guān)系Table 1 Age and body weight of the rabbits in the experimental and control groups at different times

表1 各組兔齡與體重的關(guān)系Table 1 Age and body weight of the rabbits in the experimental and control groups at different times

與對(duì)照組同期比較，*P ＜0.05

組別 n 兔齡(d) 體重(kg)對(duì)照組0 周 20 17.15±1.79 1.38±0.11 12 周 19 107.26±1.76 2.38±0.18 16 周 18 137.17±1.76 2.78±0.15 20 周 18 166.06±2.62 3.10±0.13實(shí)驗(yàn)組0 周 20 16.90±1.33 1.35±0.11 12 周 18 107.00±1.33 2.39±0.17 16 周 17 137.00±1.37 2.48±0.30*20 周 17 167.00±1.37 2.61±0.44*

2.2 兔肝組織超聲觀察 超聲評(píng)價(jià)2 組動(dòng)物模型肝情況見表2。對(duì)照組20 只兔肝全部監(jiān)測(cè)過程中，二維超聲表現(xiàn)呈中等稍低回聲，內(nèi)部回聲均勻，光點(diǎn)稍粗，管道結(jié)構(gòu)清晰，管壁與實(shí)質(zhì)對(duì)比回聲稍強(qiáng)，包膜規(guī)則、光滑，無腹水。實(shí)驗(yàn)組12 周后均發(fā)生了不同程度的脂肪肝改變，隨著喂飼期的增加，脂肪肝逐漸加重，早期以輕度脂肪肝為主，到20 周時(shí)以重度脂肪肝為主，同時(shí)6 例發(fā)生了腹水(肝腎間隙可見暗區(qū)1 ～3 cm)，進(jìn)入了肝硬化期。見圖1。

表2 兔脂肪肝程度與飼養(yǎng)周期的關(guān)系(n)Table 2 Severity of fatty liver in the experimental and control groups of rabbits at different times(n)

2.3 兔肝組織大體標(biāo)本對(duì)照 20 周處死動(dòng)物取出肝后觀察兔肝的大體標(biāo)本。對(duì)照組:肝被膜光滑，大小適中，肝外觀呈暗紅色，左葉明顯大于右葉，葉間裂清晰，邊緣銳，切面光滑;如觸口唇，彈性好，質(zhì)軟細(xì)膩。實(shí)驗(yàn)組:大部分出現(xiàn)肝被膜不光滑，肝體積較小，肝左右葉比例減小，葉間裂變小，肝邊緣變鈍，顏色為土黃色，質(zhì)地韌，如觸額頭，組織增粗。見圖2。

圖1 實(shí)驗(yàn)組兔不同程度脂肪肝的二維超聲圖像Figure 1 Two-dimension ultrasonography for the severity of alcoholic fatty liver in the experimental rabbits

圖2 兔肝組織大體標(biāo)本Figure 2 Liver specimens of the experimental and control rabbits

2.4 HE 染色分析脂肪變面積 對(duì)照組:以小葉中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉輪廓清晰，肝細(xì)胞呈多邊形，脂肪細(xì)胞量＜10%，細(xì)胞分界清，核圓，位于細(xì)胞中央，細(xì)胞質(zhì)豐富，呈嗜堿性。實(shí)驗(yàn)組:肝細(xì)胞排列十分紊亂，肝細(xì)胞胞體腫大呈球形，脂肪變面積60%～85%，細(xì)胞質(zhì)明顯減少，細(xì)胞核固縮，被脂肪滴擠壓偏位，均可見有散在和局灶性炎性細(xì)胞浸潤。見圖3。病理結(jié)果顯示對(duì)照組均未出現(xiàn)脂肪肝，實(shí)驗(yàn)組中輕度脂肪肝1 只、中度脂肪肝4 只、重度脂肪肝12 只，與超聲對(duì)兔脂肪肝的分級(jí)基本一致。見表3。

表3 兔脂肪肝的超聲分級(jí)與病理分級(jí)的關(guān)系(n)Table 3 Ultrasound and pathological grading of fatty liver in the experimental and control rabbits at 20 weeks(n)

2.5 苦味酸-天狼星紅染色分析纖維化程度 對(duì)照組:未見明顯的纖維化。實(shí)驗(yàn)組:出現(xiàn)不同程度的纖維化表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組5 只為S1-S2 期，表現(xiàn)匯管區(qū)擴(kuò)大伴纖維增生或纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留，余12只均為S3-S4 期表現(xiàn)，可見到大量纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)紊亂并分隔破壞肝小葉、匯管區(qū)炎癥明顯。見圖3。

圖3 兔肝組織HE 染色及天狼星紅染色鏡下比較(×200)Figure 3 HE and Sirius red staining of the liver tissues from the experimental and control rabbits(×200)

3 討 論

隨著人們生活水平的提高以及生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，飲酒人數(shù)和飲酒量不斷增多，導(dǎo)致酒精性肝纖維化及肝硬化發(fā)病率逐年增加，成為危害國民健康的重要因素［12－13］。研究表明平均每年約有12%的酒精性脂肪肝患者轉(zhuǎn)變成肝硬化［14］，隨著對(duì)脂肪肝機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)，動(dòng)物模型的建立也成為了關(guān)鍵，制備完善、標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物模型是研究疾病的基礎(chǔ)。從造模的成功性、穩(wěn)定性、簡(jiǎn)便性及經(jīng)濟(jì)性方面考慮，既往多選用大鼠;但家兔的肝大小適中，更適合于使用常規(guī)臨床設(shè)備行影像學(xué)研究［15］，兔與人類飲酒所致的肝脂肪代謝相似，可更快地復(fù)制出人脂肪肝模型，且病死率低，因此本實(shí)驗(yàn)選用新西蘭大耳兔造模。飲水中加入乙醇是最早的造模方法，但動(dòng)物厭酒，主動(dòng)攝食乙醇的量較低，且乙醇易于揮發(fā)，濃度隨著放置時(shí)間的延長而減低，故造模成功率不高，本實(shí)驗(yàn)采用乙醇2 次/d 灌胃，不僅保證了兔每天的飲酒量一致，還保持了兔體內(nèi)24 h 較穩(wěn)定的乙醇濃度。因此，我們通過定量乙醇灌胃的方法制備酒精性脂肪肝兔模型。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組兔于12 周后均發(fā)生了不同程度的脂肪肝改變，且隨著喂飼期的延長，脂肪肝逐漸加重，早期以輕度脂肪肝為主，到20 周時(shí)以重度脂肪肝，而對(duì)照組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均未發(fā)生脂肪肝病變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乙醇灌胃的方法制備酒精性脂肪肝兔模型具有乙醇的攝入量容易控制，影響因素少，可控性強(qiáng)，重復(fù)性好，成功率高，造模時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。酒精性脂肪肝兔模型的建立為今后研究酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制以及藥物治療提供了良好的模型動(dòng)物［16］。

目前臨床上公認(rèn)的脂肪肝診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是肝穿刺病理學(xué)診斷，但由于其具有創(chuàng)傷性，很難作為臨床和篩查的有效方法［17］。而體外超聲具有無創(chuàng)傷、操作簡(jiǎn)便、可控性好等優(yōu)點(diǎn)，可作為診斷和篩查酒精性脂肪肝的有效方法。本研究發(fā)現(xiàn)2 組兔經(jīng)過預(yù)設(shè)飼養(yǎng)條件喂養(yǎng)12 周后，通過二維超聲觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)照組兔肝超聲顯示無異常，實(shí)驗(yàn)組所有兔均發(fā)生了脂肪肝改變，12 周時(shí)二維超聲觀察后明確動(dòng)物模型制備成功。隨著飼養(yǎng)期的延長，二維超聲監(jiān)測(cè)全過程中對(duì)照組正常飲食飼養(yǎng)的兔肝 表現(xiàn)為正常肝聲像。實(shí)驗(yàn)組二維超聲表現(xiàn)為肝增大，回聲增高，前方明顯，后方部分衰減，光點(diǎn)細(xì)密，管道結(jié)構(gòu)較對(duì)照組模糊。二維超聲檢查對(duì)兔脂肪肝的分級(jí)與病理分級(jí)基本一致，其中一列病理分級(jí)為中度脂肪肝，超聲分級(jí)為重度脂肪肝，這可能與脂肪肝后期兔子的消化功能受損導(dǎo)致腸氣干擾明顯，以及腹水形成等影響超聲檢查有關(guān)。這也就說明，常規(guī)超聲檢查評(píng)價(jià)脂肪肝分級(jí)具有一定局限性，即易受到腸氣、腹水等因素的影響，且具有一定主觀性，因此評(píng)價(jià)脂肪肝程度還需引入相關(guān)檢查手段。此外2 組兔齡和體重在實(shí)驗(yàn)前基本相當(dāng)，但隨著飼養(yǎng)期的延長，體重也出現(xiàn)了明顯差異，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)兔的生長發(fā)育受到了限制，與肝損傷有明顯關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)通過酒精性脂肪肝兔模型來研究常規(guī)超聲檢查技術(shù)在動(dòng)物脂肪肝診斷方面的應(yīng)用，明確常規(guī)超聲檢查能判斷脂肪肝兔模型建立是否成功，且常規(guī)超聲檢查能初步判斷脂肪肝病變的程度，為進(jìn)一步分析兔酒精性脂肪肝超聲定量評(píng)價(jià)與肝臟病理形態(tài)學(xué)改變程度的相關(guān)性研究奠定了基礎(chǔ)，但本實(shí)驗(yàn)觀察例數(shù)較少，還需進(jìn)一步擴(kuò)大標(biāo)本量加以研究。且動(dòng)物模型試驗(yàn)是一種間接性研究，只能在局部或某方面與人類疾病相似，兔為食草動(dòng)物，與人類代謝機(jī)制不同，故動(dòng)物模型試驗(yàn)結(jié)論的正確性是相對(duì)的，最終還必須在人體上得到驗(yàn)證。

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