石瑞峰，劉 玲，胡 斌，陳 昕，曹琴琴，趙玲玲，張仁良

0 引 言

腦卒中是世界范圍內(nèi)致死率和致殘率極高的疾病之一［1］。糖尿病已成為公認(rèn)的缺血性腦卒中的獨立危險因素。據(jù)估計，糖尿病患者發(fā)生腦卒中的風(fēng)險較非糖尿病患者高1.5 ～3 倍。有研究報道，8%～63%的非糖尿病患者和39%～83%的糖尿病患者發(fā)生腦缺血性事件的同時伴發(fā)高血糖［2-3］。臨床研究證實，糖尿病患者腦卒中后的短期及長期預(yù)后均較非糖尿病患者差，并且病死率相對較高［4-5］。研究表明，炎癥反應(yīng)是加重糖尿病患者腦缺血再灌注損傷的重要機制之一［6］。因此，抑制腦缺血再灌注損傷過程中的炎癥反應(yīng)對糖尿病患者具有神經(jīng)保護(hù)作用。大量動物實驗研究表明，組織激肽釋放酶通過抑制炎癥、減少凋亡、促進(jìn)神經(jīng)及血管再生對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用［7-9］。然而，大量研究發(fā)現(xiàn)，并發(fā)糖尿病大鼠腦組織缺血再灌注后對部分神經(jīng)保護(hù)的藥物或者缺血前后預(yù)處理有抵抗性［10-11］;且組織激肽釋放酶對于糖尿病并發(fā)腦卒中是否具有神經(jīng)保護(hù)作用尚未有研究證實。因此，本實驗旨在通過觀察組織激肽釋放酶對糖尿病大鼠腦缺血再灌注后的行為學(xué)、腦梗死面積百分比、腦水腫程度改變、炎癥細(xì)胞激活和細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響，探討組織激肽釋放酶的神經(jīng)保護(hù)作用，為組織激肽釋放酶治療并發(fā)腦卒中的糖尿病患者提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康清潔級成年雄性SD大鼠(100 ～150 g)，由我院比較醫(yī)學(xué)科提供，實驗動物合格證號:CXK(軍)2007-012。將動物置于實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，自由進(jìn)食、飲水，室溫(23±2)℃，相對濕度55%，每天光照12 h。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、等滲鹽水組和組織激肽釋放酶組，每組16 只。缺血再灌注后，等滲鹽水組及組織激肽釋放酶組立即分別尾靜脈注射等滲鹽水0.5 mL/kg和組織激肽釋放酶1.6×10-2PNAU/kg(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司)，假手術(shù)組于術(shù)后尾靜脈注射等滲鹽水0.5 mL/kg。實驗過程嚴(yán)格遵循科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 動物模型制作及組織標(biāo)本制備

1.2.1 糖尿病模型制備 參照文獻(xiàn)［12］制備糖尿病大鼠模型。各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后過渡為高脂飼料，4 周后禁食12 h，后腹腔注射STZ(美國Sigma 公司)35 mg/kg，常規(guī)喂養(yǎng)14 d，分別于注射STZ后第3、7 及14 天用血糖儀測定尾尖血糖，測定前禁食8 h，3 次血糖均＞16.7 mmol/L 為模型制備成功，未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)或未到時間點死亡者，剔除后補充。

1.2.2 局灶性腦缺血再灌注模型制備 參照文獻(xiàn)［13］采用longa 法進(jìn)行。腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，頸前正中切口2 cm，充分暴露并分離側(cè)頸總、頸內(nèi)及頸外動脈，用動脈夾分別夾閉頸總及頸內(nèi)動脈，永久性結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)心端，另一粗線暫時結(jié)扎頸外動脈近心端，在兩結(jié)扎點之間剪一小口，將特制尼龍栓線插入后用絲線固定并解開近心端粗線，離斷頸外動脈剪口，繼續(xù)插入至頸總動脈分叉處時，松開頸內(nèi)動脈夾，將栓線拉向下方使之與頸內(nèi)動脈成一直線并順頸內(nèi)動脈方向插入，直至大腦中動脈與大腦前動脈分叉處(此時阻力增大，線頭距頸總動脈分叉處約18 mm)，松開頸總動脈夾，缺血90 min 后將栓線拔出至頸外動脈殘端，實現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組僅暴露頸總動脈而不插入栓線。造模過程中使用烤燈維持大鼠肛溫37 ℃。

1.2.3 標(biāo)本留取 每組3 只大鼠腦缺血90 min 再灌注24 h，經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉后開胸，從心尖處向主動脈弓注入0.9%氯化鈉溶液250 mL 行心臟灌注，隨后用4%多聚甲醛250 mL(溶解于0.1 mol/L PBS 中，pH=7.4)灌注，固定后取腦，置于4%多聚甲醛后固定8 h，隨后于30%蔗糖溶液中脫水沉糖24 h，經(jīng)OCT 包埋劑包埋后行冰凍切片。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 神經(jīng)功能缺損評分 每組分別隨機取6 只大鼠，參照改良神經(jīng)功能缺損評分(modified Neurological Severity Scores，NSS)［14］行神經(jīng)功能評價:0分為正常;1 ～6 分為輕度神經(jīng)功能損傷;7 ～12 分為中度神經(jīng)功能損傷;13 ～18 分為重度神經(jīng)功能損傷。在模型制作后24 h 進(jìn)行評分。0 分者及未到24 h 死亡者剔除，隨機補充。

1.3.2 腦梗死面積測定 每組分別隨機取4 只大鼠，缺血再灌注24 h 后斷頭取腦，沿冠狀位從額極至枕葉以厚度2 mm/片切成6 片，TTC 磷酸鹽緩沖液中，37 ℃避光孵育15 min，隨后用4%多聚甲醛固定。掃描并用Image-J 測定每張腦片梗死面積，并計算梗死面積百分比。

1.3.3 腦水腫測定 每組分別隨機取6 只大鼠，缺血再灌注24 h 后斷頭取腦，取梗死側(cè)半球于精密電子天平稱重為濕重(WW)，隨后將腦組織置入100 ℃烘箱中烘烤24 h，再次稱重記錄為干重(DW)，計算公式如下:

腦水腫程度=［(WW-DW)/WW］×100%

1.3.4 小膠質(zhì)細(xì)胞離子鈣接頭蛋白(ionized calcium bindingadaptor molecule-1，Iba1)及髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)免疫組化染色 切片置于4%多聚甲醛中固定15 min 后，于0.3%H2O2浸泡30 min，隨后置于0.1%Triton 15 min，加5%牛血清蛋白封閉1 h;分別滴加兔抗鼠Iba1 抗體(1∶1000)及MPO抗體(1∶200)，4 ℃，24 h;滴加生物素化羊抗兔IgG二抗(1∶200)，37 ℃，2 h;滴加SABC 后用DAB-H2O2顯色。每步之間用0.1 mol/L PBS(pH=7.4)沖洗3次，每次5 min。常規(guī)脫水，透明，封固。

1.3.5 腦組織血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)及缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)mRNA 表達(dá)測定 采用RT-PCR 方法測定腦組織中VCAM-1 及ICAM-1 表達(dá)水平。每組分別取3 只大鼠，再灌注24 h 后斷頭取腦，取缺血半暗帶皮質(zhì)區(qū)標(biāo)本采用Trizol 抽提RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄將總RNA 反轉(zhuǎn)為cDNA，使用PCR 儀擴增，擴增使用引物序列如下:VCAM-1:5'-TGCTCCTGACTTGCAGCACCAC-3'，5'-TGTCATCGTCACAGCAGCACCC-3';ICAM-1:5'-TGCAGCCGGAAAGCAGATGGTG-3'，5'-ATGGACGCCACGATCACGAAGC-3'; GAPDH: 5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3'，5'-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3'。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，行為學(xué)采用Kruskal-Wallis 非參數(shù)檢驗，多重比較經(jīng)Bonferroni 校正;多個均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗;方差不齊時行Welch 校正的Dunnett'sT3 檢驗。以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分 假手術(shù)組大鼠無明顯神經(jīng)功能缺損，等滲鹽水組及組織激肽釋放酶組大鼠均有不同程度的神經(jīng)功能缺損，且組織激肽釋放酶組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分明顯低于等滲鹽水組(P ＜0.01)。見圖1。

圖1 大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能缺損評分比較Figure 1 Neurological Severity Scores of different groups of rats 24 h after MCAO

2.2 大鼠腦梗死面積百分比 等滲鹽水組及組織激肽釋放酶組經(jīng)TTC 染色梗死區(qū)呈蒼白色，主要位于額頂葉皮質(zhì)及紋狀體(即MCA 供血區(qū))，未缺血區(qū)呈紅色。假手術(shù)組未見梗死區(qū)域，組織激肽釋放酶組梗死面積百分比較等滲鹽水組顯著降低(P ＜0.05)。見表1，圖2。

表1 大鼠各項觀察指標(biāo)比較Table 1 Infarct area，brain edema，Iba1-and MPO-positive cells，and expressions of VCAM-1 and ICAM-1 in different groups of rats

圖2 TTC 染色觀察各組大鼠腦梗死面積Figure 2 TTC staining for different groups of rats at 24 h after MCAO

2.3 大鼠腦水腫程度比較 腦水腫是反映腦組織早期炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)之一。等滲鹽水組腦水腫程度高于假手術(shù)組(P ＜0.05)，并且組織激肽釋放酶組腦水腫程度低于等滲鹽水組(P ＜0.05)。見表1。

2.4 小膠質(zhì)細(xì)胞及髓過氧化物酶免疫組化染色I(xiàn)ba1 是小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，卒中后炎癥反應(yīng)導(dǎo)致其呈活化狀態(tài)。假手術(shù)組雙側(cè)大腦半球、等滲鹽水組和組織激肽釋放酶組缺血對側(cè)半球少見Iba1 陽性細(xì)胞，缺血半暗帶區(qū)Iba1 陽性細(xì)胞表達(dá)較多，缺血核心區(qū)Iba1 陽性細(xì)胞表達(dá)較少。等滲鹽水組Iba1 陽性細(xì)胞表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P ＜0.05)，并且組織激肽釋放酶治療組Iba1陽性細(xì)胞表達(dá)較等滲鹽水對照組顯著降低(P ＜0.05)。見表1，圖3。

MPO 是中性粒細(xì)胞活化標(biāo)志蛋白，缺血再灌注后梗死邊緣區(qū)MPO 表達(dá)顯著增多，假手術(shù)組未見陽性細(xì)胞，等滲鹽水組見大量MPO 免疫染色陽性的中性粒細(xì)胞，經(jīng)組織激肽釋放酶治療后MPO 表達(dá)顯著降低(P ＜0.05)。見表1，圖4。

圖4 高倍鏡下觀察各組大鼠腦組織中MPO 陽性細(xì)胞(免疫組化染色 ×200)Figure 4 Count of MPO-positive cells wascounted in different groups of rats at 24 h after MCAO(IHC ×200)

2.5 VCAM-1 及ICAM-1mRNA 表達(dá) 缺血再灌注24 h 后，各組缺血半暗帶皮質(zhì)區(qū)VCAM-1 及ICAM-1 表達(dá)水平存在顯著性差異。與假手術(shù)組相比，等滲鹽水對照組VCAM-1、ICAM-1 表達(dá)水平提高(P ＜0.05);與等滲鹽水對照組相比，組織激肽釋放酶治療組VCAM-1 及ICAM-1 表達(dá)水平顯著降低(P ＜0.05)。見表1。

3 討 論

高血糖不僅是腦卒中發(fā)生的獨立危險因素，也是加重腦卒中不良預(yù)后的主要原因。單純控制糖尿病患者血糖并不能提高卒中后神經(jīng)功能的恢復(fù)，急性期內(nèi)血管再通仍為首選治療方法。然而，急性期血管內(nèi)再通導(dǎo)致缺血再灌注損傷，加重局部炎癥反應(yīng)及神經(jīng)細(xì)胞損傷。

在腦缺血病理過程中，谷氨酸介導(dǎo)的興奮性中毒、鈣離子超載、氧化應(yīng)激反應(yīng)、壓力信號通路、神經(jīng)血管病理生理反應(yīng)及炎癥、細(xì)胞凋亡及壞死等多種因素均發(fā)揮重要作用［15］。機體在高血糖狀態(tài)下，不僅出現(xiàn)細(xì)胞及內(nèi)部功能紊亂導(dǎo)致代謝異常，基因的表達(dá)也會出現(xiàn)異常變化，加重缺血后腦組織損傷［16］。研究表明，高血糖通過激活核因子-κB 提高黏附分子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)白細(xì)胞的黏附［3］。另外，高血糖能加速高遷移率蛋白-1 的釋放從而促進(jìn)缺血后腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，加劇炎癥反應(yīng)［17］。

組織激肽釋放酶是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(kallikrein-kinin system，KKS)的成員之一。作為體內(nèi)重要的炎性調(diào)節(jié)系統(tǒng)，KKS 主要包括激肽釋放酶、激肽原和激肽，激肽原在激肽釋放酶的作用下轉(zhuǎn)化為激肽和緩激肽，后者作用于緩激肽受體1(bradykinin 1 receptor，B1R)和/或受體2(B2R)或蛋白酶活化受體(protease activated receptors，PARs)，激肽釋放酶廣泛存在于組織及血漿之中，存在于組織中者稱為組織激肽釋放酶。大量研究已證實，組織激肽釋放酶可對多種炎癥細(xì)胞發(fā)揮抑制作用，抑制缺血再灌注損傷激活的細(xì)胞因子和黏附分子表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)［7］。緩激肽受體在糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠腦缺血再灌注后表達(dá)及作用由明顯差異。在本研究中，與等滲鹽水組相比，組織激肽釋放酶組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分顯著改善、梗死面積減小、腦水腫程度明顯降低，表明組織激肽釋放酶對糖尿病腦缺血再灌注起顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。本實驗采用2 型糖尿病大鼠模型制備方法，經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)與低劑量STZ 聯(lián)合誘導(dǎo)，以模仿臨床常見的2 型糖尿病病理模型［10］。缺血再灌注模型采用經(jīng)典longa 線栓法誘導(dǎo)，以模仿臨床急性腦卒中患者溶栓或取栓后腦組織缺血再灌注損傷病理生理過程［11］。Chen 等［8］研究通過對大鼠腦缺血再灌注給予組織激肽釋放酶后不同時間點的研究已表明，24 h 后大鼠行為學(xué)、腦水腫、凋亡及炎癥水平均出現(xiàn)顯著統(tǒng)計學(xué)差異，因為本實驗研究選取給藥后24 h 作為標(biāo)本采集時間點。

小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的“清道夫”，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時起重要作用，然而過度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞會分泌大量細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性物質(zhì)，引發(fā)神經(jīng)毒性［18］。在本實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)組織激肽釋放酶治療后的大鼠腦組織缺血半暗帶區(qū)域激活的小膠質(zhì)細(xì)胞顯著低于等滲鹽水組，這與Noda 等［19］的研究結(jié)果一致。該研究表明，緩激肽通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1β 和TNF-α 調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

缺血后再灌注時，大量活化的白細(xì)胞在受損的內(nèi)皮細(xì)胞表明滾動、黏附，最終滲入周圍組織，釋放蛋白酶、氧自由基等物質(zhì)加重內(nèi)皮損傷，改變內(nèi)皮通透性，加重血腦屏障的破壞，進(jìn)而加重腦組織水腫且減少再灌注血流。滲入組織的白細(xì)胞通過呼吸爆發(fā)及溶酶體酶的釋放進(jìn)一步加重缺血腦組織損傷［20］。MPO 作為中性粒細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，可評估活化中性粒細(xì)胞在組織中的遷移［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷后，MPO 陽性染色細(xì)胞數(shù)目增多，經(jīng)組織激肽釋放酶治療后明顯減少，表明早期組織激肽釋放酶治療可減輕炎癥介導(dǎo)的缺血性神經(jīng)功能損害。

黏附分子作為卒中后抗炎藥物靶點，在腦卒中后的白細(xì)胞遷移過程中發(fā)揮重要作用。上已述及，白細(xì)胞從血管滲入腦組織需經(jīng)過滾動、黏附以及游出3 個步驟。細(xì)胞黏附分子作為介導(dǎo)白細(xì)胞聚集、游出血管的關(guān)鍵性物質(zhì)主要包括3 種:選擇素、免疫球蛋白超家族和整合素。免疫球蛋白超家族包括5種分子，其中ICAM-1 在內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞膜表面持續(xù)低水平表達(dá)，細(xì)胞因子刺激能使其表達(dá)上調(diào)，VCAM-1 在腫瘤壞死因子-α 和白細(xì)胞介素-1 的誘導(dǎo)下表達(dá)上調(diào)［22-23］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠缺血再灌注后，腦組織內(nèi)ICAM-1 及VCAM-1 mRNA表達(dá)均顯著升高，而再灌注早期給予組織激肽釋放酶治療可明顯降低上述黏附分子的表達(dá)水平，從而抑制白細(xì)胞的游走滲出，減輕炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本實驗顯示組織激肽釋放酶對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷模型具有神經(jīng)保護(hù)作用。組織激肽釋放酶通過降低ICAM-1 和VCAM-1 mRNA 的表達(dá)減少中性粒細(xì)胞的浸潤，同時抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，從而減輕缺血再灌注引發(fā)的炎癥反應(yīng)，減少梗死面積，減輕腦水腫，從而改善神經(jīng)功能。因此，組織激肽釋放酶發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用機制可能與抑制腦缺血再灌注局部炎癥反應(yīng)有關(guān)。本實驗證實組織激肽釋放酶對抑制糖尿病大鼠腦缺血再灌注局部炎癥有效，有望為糖尿病患者卒中早期臨床用藥提供實驗依據(jù)。

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