陳立杰，常明秀，靳京美，曹 月，王 銳，張雪梅

（1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江哈爾濱150081；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3.大慶龍南醫(yī)院內(nèi)科）

高蛋氨酸飲食對大鼠血管平滑肌細胞作用的實驗研究

陳立杰1＊，常明秀2，靳京美3，曹 月1，王 銳1，張雪梅1

（1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江哈爾濱150081；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3.大慶龍南醫(yī)院內(nèi)科）

目的研究高蛋氨酸（Methionine，Met）飲食對大鼠血漿同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）和硫腺苷同型半胱氨酸（S－adenosylhomocysteine，SAH）濃度及頸動脈血管平滑肌細胞的影響，同時觀察葉酸、維生素B12對其血管損害的保護作用。方法 選取Wistar雄性大鼠21只，隨機分為三組：對照組給予正常飼料，高蛋氨酸組給予添加1%高蛋氨酸的飼料；干擾組給予1%高蛋氨酸同時添加葉酸、維生素B12飼料。飼喂動物10周后留取腹主動脈血檢測Hcy、SAH濃度，留取頸總動脈標本行HE染色，并計算平滑肌厚度指數(shù)（Smooth muscle thickness index，SMTI）。結(jié)果 高蛋氨酸組大鼠血漿Hcy水平較對照組及干擾組明顯增高（P＜0.05），血漿SAH水平較對照組明顯下降（P＜0.05），SMTI較對照組及干擾組明顯增高（P＜0.05）。結(jié)論 高蛋氨酸飲食對Wistar雄性大鼠具有毒性作用，能引起血漿Hcy水平升高，SAH水平下降，引起動脈平滑肌損傷，并且這種血管損傷可能是由于血漿Hcy水平增高所致。葉酸、維生素B12具有拮抗高蛋氨酸飲食所致的高Hcy血癥，對血管損傷具有一定的保護作用。

蛋氨酸；同型半胱氨酸；硫腺苷同型半胱氨酸；血管平滑肌細胞

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1622）

通過飲食攝入的過量蛋氨酸進入機體后可通過蛋氨酸循環(huán)轉(zhuǎn)化生成血漿同型半胱氨酸（Hcy），此前多項研究認為Hcy是一種具有神經(jīng)毒性的物質(zhì)，是腦血管閉塞性疾病的獨立危險因素［1］，因此，高蛋氨酸飲食具有血管損害作用，但是目前關(guān)于其致病的確切機制尚無定論。而近年來有研究顯示血漿Hcy的前體物質(zhì)硫腺苷同型半胱氨酸（SAH）可通過誘導(dǎo)整體基因低甲基化或個別基因高甲基化等方式造成血管平滑肌損害，導(dǎo)致動脈粥樣硬化，而Hcy介導(dǎo)的血管損害可能是由于SAH的蓄積所致［2］。本研究旨在通過大鼠血漿SAH和Hcy的測定及血漿葉酸、維生素B12水平的測定，觀察腦動脈血管平滑肌厚度的變化，進一步明確高蛋氨酸飲食導(dǎo)致的腦動脈損害過程中Hcy及SAH所具有的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組與處理

選取Wistar雄性大鼠21只進行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后稱重，然后隨機分為三組分籠喂養(yǎng)，每組7只。對照組：飼喂普通大鼠飼料；高蛋氨酸組：在標準飼料中加入1%高蛋氨酸；干擾組：在高蛋氨酸組基礎(chǔ)上加入0.003%葉酸以及0.00002%維生素B12，均喂養(yǎng)10周，定期稱重，實驗期滿時行腹主動脈采血5ml于含有EDTA抗凝劑的采血管中，3 000r／min離心10－15min，血漿凍存于－80°冰箱中，成批測定血漿Hcy及血漿SAH濃度指標。分離的頸總動脈于冰凍PBS溶液中漂洗數(shù)秒鐘后用OCT包埋劑進行包埋，將包埋盒立即放入液氮罐中冷凍保存。

1.2 血Hcy及SAH濃度測定

應(yīng)用雅培i2000化學(xué)發(fā)光儀（購自美國雅培公司）測定大鼠血漿Hcy濃度，大鼠血漿硫腺苷同型半胱氨酸測定的ELISA試劑盒（購自上海江萊生物科技有限公司）測定血漿SAH濃度。

1.3 頸總動脈HE染色

將頸動脈置于冰凍切片機上行冰凍切片，片厚為8μm，后行HE染色，100倍光鏡下照相、觀察，并計算SMTI。

1.4 實驗數(shù)據(jù)的分析與統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析及圖形的制作均應(yīng)用GraphPad Prism軟件，計量資料平均值均用x—±s表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0進行正態(tài)分布檢驗方差齊性檢驗及方差分析，以P＜0.05認為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 實驗期間大鼠臨床表現(xiàn)

實驗期間，3組大鼠體重逐漸增加，未見因發(fā)生其他疾病而死亡的大鼠。其中對照組發(fā)育良好，表現(xiàn)正常，攝食飲水量正常，精神狀態(tài)良好；高蛋氨酸組大鼠反應(yīng)減慢，活動遲鈍，攝食及飲水量較對照組略少，7周后偶有大鼠出現(xiàn)行走不穩(wěn)；干擾組精神狀態(tài)好，對聲音刺激敏感，運動異?；钴S，攝食及飲水量較對照組及高蛋氨酸組略多，偶有精神過度緊張。

2.2 血漿Hcy及SAH濃度測定

結(jié)果見表1。

表1 血漿Hcy和SAH濃度

表1 血漿Hcy和SAH濃度

注：a：與對照組比較P＜0.05；b：與高蛋氨酸組相比P＜0.05。

組別血漿Hcy濃度血漿SAH濃度n（mol／L）（ng／L）μ對照組7 14.97±2.16 92.41±5.14高蛋氨酸組7 26.07±7.63a75.60±6.23a干擾組7 16.55±2.25b84.46±11.15

2.3 動脈血管的病理學(xué)觀察

2.3.1 HE染色結(jié)果（×100倍放大） 見圖1。

圖1 動脈血管HE染色結(jié)果

2.3.2 動脈血管平滑肌相對厚度測定及動脈平滑肌厚度指數(shù)（Smooth muscle thickness index，SMTI）

動脈平滑肌厚度指數(shù)（SMTI）＝動脈平滑肌細胞相對厚度（mm）／體重（g）。

實驗期滿時三組大鼠平均體重為：對照組（g）：501.07±27.01，高蛋氨酸組（g）：456.14±28.99，干擾組（g）：504.43±30.83。

表2 動脈平滑肌厚度及SMT

表2 動脈平滑肌厚度及SMT

注：a與對照組比較P＜0.05；b與高蛋氨酸組比較P＜0.05。

組別n厚度（μm）SMTI（μm／g）7 32.04±2.87 0.0642±0.0075高蛋氨酸組7 39.43±6.38a0.0865±0.0134a干擾組7 34.65±3.38 0.0670±0.0072對照組b

3 討論

3.1 高蛋氨酸飲食的毒性作用

研究指出給予高蛋氨酸飲食的哺乳動物可以表現(xiàn)明顯的神經(jīng)毒性癥狀［1］，本實驗結(jié)果顯示高蛋氨酸組大鼠體重減輕，精神狀態(tài)，反應(yīng)速度均較正常對照組減弱，活動量少，偶有出現(xiàn)肢體力弱，走路偏斜，考慮為高蛋氨酸飲食所致神經(jīng)系統(tǒng)中毒作用，給予葉酸及維生素B12干擾后的大鼠攝食飲水量及體重較對照組及高蛋氨酸組均增加，精神狀態(tài)良好，對聲音光線刺激敏感，說明葉酸、維生素B12具有拮抗這種毒性損害的作用。這與以往研究觀察結(jié)果相同，也支持關(guān)于Hcy具有神經(jīng)血管損害作用的理論［3，4］。

3.2 Hcy與動脈血管平滑肌細胞

攝入體內(nèi)的高蛋氨酸主要進入蛋氨酸循環(huán)，通過代謝轉(zhuǎn)化生成Hcy，此前多項研究指出血Hcy濃度的過度增高可以通過損傷血管或者其他多種作用機制導(dǎo)致腦血管疾病的發(fā)生。由于Hcy水平增高仍普遍被認為是一種損害性氨基酸，目前臨床上已將其視為腦血管疾病重要危險因素而定量篩查。在本實驗中高蛋氨酸組動物血Hcy水平較對照組明顯增高、血SAH水平下降，伴有VSMCs排列混亂，動脈平滑肌厚度指數(shù)增加，說明高蛋氨酸飲食可能通過增加Hcy濃度促進VSMCs增殖，從而對血管產(chǎn)生毒性作用。有關(guān)機制研究指出血Hcy水平增加可以通過介導(dǎo)脂肪因子抵抗，從而導(dǎo)致VSMCs增加，說明Hcy與VSMCs增殖具有相關(guān)關(guān)系［5］。還有研究指出高Hcy可以抑制內(nèi)皮細胞生長來促進血管平滑肌細胞增殖［6］。因此，Hcy對腦血管疾病的風險預(yù)測具有一定意義。此外，許多研究認為Hcy水平增高可能是多種阻塞性心臟疾病、癡呆、神經(jīng)退行性疾病的危險因素。Hcy在各種疾病之間是否存在交互作用，以及Hcy是否是通過直接抑或非直接作用于血管引起的病理生理損傷仍待進一步研究。

3.3 SAH與動脈血管平滑肌細胞

雖然體內(nèi)甲基化反應(yīng)的直接供體是硫腺苷蛋氨酸，但是，由于SAH與硫腺苷蛋氨酸所依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶催化區(qū)具有更高的親和力，SAH可通過改變甲基轉(zhuǎn)移酶催化區(qū)的結(jié)構(gòu)從而抑制其活性，進而引起DNA低甲基化從而損傷血管［7，8］。本實驗中在高蛋氨酸組血Hcy濃度較對照組明顯增高的同時，表現(xiàn)出VSMCs損害，卻伴有SAH水平降低，這與此前研究的結(jié)果有所不同［9，10］。對此我們推測：由于正常機體蛋氨酸循環(huán)中Hcy向SAH的轉(zhuǎn)化是應(yīng)處于一個動態(tài)平衡中，且多基于體內(nèi)Hcy水平嚴重增高的基礎(chǔ)之上，而在本實驗中可能由于高蛋氨酸組血漿Hcy升高的程度有限，未出現(xiàn)重度高Hcy血癥，血Hcy向SAH轉(zhuǎn)化減少，而SAH被消耗生成腺苷的反應(yīng)未見減弱甚至增強所致。限于本研究的樣本數(shù)較少，其確切機制尚有待于進一步深入研究。

3.4 葉酸、維生素B12對血Hcy和SAH的影響及血管損害的保護作用

此前研究認為葉酸、B族維生素可通過降低血Hcy水平，改善高Hcy血癥所致的血管損傷，近年有報道指出受孕母體中血維生素B12水平缺乏、Hcy水平增高與神經(jīng)管損害有關(guān)，因此人們推測增加葉酸、維生素B12及其他富含甲基飲食可降低血Hcy水平，減少受孕后的神經(jīng)管損害從而起到良性作用［11］。2011年P(guān)izzolo F也指出葉酸可以干預(yù)升高的血Hcy水平，但對整體基因甲基化水平則可能無效［12］。最近的研究指出高劑量的葉酸可能通過降低血Hcy水平、增加BH4和NO的含量而起到對血管內(nèi)皮細胞的保護作用［13］。而本研究中發(fā)現(xiàn)在給予大鼠葉酸、維生素B12飲食干預(yù)后血Hcy濃度下降，SAH水平未見明顯改變，同時其血管損害程度均較高蛋氨酸組明顯減輕，說明葉酸及維生素B12可明顯改善高蛋氨酸飲食所造成的血管損害，其機制可能是通過其降低Hcy水平所致，這與以往研究結(jié)果相同［10，14］。目前，關(guān)于SAH與腦血管疾病的相關(guān)關(guān)系，SAH對VSMCs以及動脈粥樣硬化的真正作用機制尚無定論，仍有待于未來進行深入的研究證實。

［1］Ho PI，Ortiz D，Rogers E，et al.Multiple aspects of homocysteine neurotoxicity：glutamate excitotoxicity，kinase hyperactivation and DNA damage［J］.J Neurosci Res，2002，70（5）：694.

［2］Sipkens JA，Hahn NE，Blom HJ，et al.S－Adenosylhomocysteine induces apoptosis and phosphatidylserine exposure in endothelial cells independent of homocysteine［J］.Atherosclerosis，2012，221（1）：48.

［3］Kivipelto M，Annerbo S，Hultdin J，et al.Homocysteine and holotranscobalamin and the risk of dementia and Alzheimers disease：a prospective study［J］.Eur J Neurol，2009，16（7）：808.

［4］Gao L，Zeng XN，Guo HM，et al.Cognitive and neurochemical alterationgs in hyperhomocysteinemic rat［J］.Neuro Sci，2012，33（1）：39.

［5］Jiang C，Zhang H，Zhang W，et al.Homocysteine promotes vascular smooth muscle cell migration by induction of the adipokine resistin［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2009，297（6）：C1466.

［6］Xiaohua Jiang，F(xiàn)an Yang，Eugen Brailoiu，et al.Differential Regulation of Homocysteine Transport in Vascular Endothelial and Smooth Muscle Cells［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27：1976.

［7］Cohen HM，Griffiths AD，Tawfik DS，et al.Determinants of cofactor binding to DNA methyltransferases：insights from a systematic series of structural variants of S－adenosylhomocysteine［J］.Org Biomol Chem，2005，3（1）：152.

［8］Zawada AM，Rogacev KS，Hummel B，et al.S－adenosylhomocysteine is associated with subclinical atherosclerosis and renal function in a cardiovascular low－risk population［J］.Atherosclerosis，2014，234（1）：17.

［9］Dayal S，Bottiglieri T，Arning E，et al.Endothelial dysfunction and elevation of S－adenosylhomocysteine in cystathionine beta－synthase－deficient mice［J］.Circ Res，2001，88（11）：1203.

［10］Becker A，Smulders YM，Teerlink T，et al.S－adenosylhomocysteine and the ratio of S－adenosylmethionine to S－adenosylhomocysteine are not related to folate，cobalamin and vitamin B6concentrations［J］.Eur J Clin Invest，2003，33（1）：17.

［11］Imbard A，Benoist JF，Blom HJ.Neural tube defects，folic acid and methylation［J］.Int J Environ Res Public Health，2013，10（9）：4352.

［12］Pizzolo F，Blom HJ，Choi SW，et al.Folic acid effects on S－adenosylmethionine，S－adenosylhomocysteine，and DNA methylation in patients with intermediate hyperhomocysteinemia［J］.J Am Coll Nutr，2011，30（1）：11.

［13］Min Zhang，Jinlin Wen，Xiangjiang Wang，et al.Highdose folic acid improves endothelial function by increasing tetrahydrobiopterin and decreasing homocysteine levels［J］.Mol Med Rep，2014，1609.

［14］Green TJ，Skeaff CM，McMahon JA，et al.Homocysteine－lowering vitamins do not lower plasma S－adenosylhomocysteine in older people with elevated homocysteine concentrations［J］.Br J Nutr，2010，103（11）：1629.

Experimental Study Of High Methionine Diet On Vascular Smooth Muscle Cells

CHEN Li－jie，CHANG Ming－xiu，JIN Jing－mei，et al.
（The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University Department of Neurology，Harbin 150081，China）

ObjectiveTo investigate the impact of High methionine diet on the concentration of Homocysteine（Hcy）and S－adenosylhomocysteine（SAH）and the carotid artery vascular smooth muscle cells in rats，observe the protective effect of folic acid and vitamin B12on the vascular damage.Methods 21male Wistar rats were selected，randomly divided into three groups：The control group received normal diet，the high methionine group were added 1% high methionine on the basis of normal diet，the intervention group adding folic acid and vitamin B12on the basis of the high methionine group.Feeding these diets for 10weeks，then collecting the abdominal aortic blood for detection the concentrations of Hcy and SAH，isolating the carotid artery for HE staining and calculating the smooth muscle thickness index（SMTI）.Results The concentration of homocysteine in the high methionine group was significantly higher than the control group and the intervention group（P＜0.05），the SAH level was significantly reduced contrary to the control group（P＜0.05），SMTI was significantly higher than the control group and the intervention group（P＜0.05）.Conclusion High methionine diet has a toxic effect on the male Wistar rats，it can lead to the elevated of Hcy concentration，the decreased of plasma SAH level and the damaged of vascular smooth muscle cell，besides，the elevated homocysteine level may be the reason that causes this vascular damage.Folic acid，vitamin B12have the effects that antagonist the hyperhomocystinemia which are leaded by the high methionine diet and has a protective effect on the vascular damage.

methionine；homocysteine；sulfur adenosine homocysteine；vascular smooth muscle cell

R543.4

A

陳立杰，女，主任醫(yī)師、教授、博士，主要從事缺血性腦血管疾病的臨床與基礎(chǔ)研究。

2014－11－18）

1007－4287（2015）10－1622－04

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究資助項目（12511266）

＊為通訊作者