斯慶圖娜拉

（鄂爾多斯市中心醫(yī)院，內(nèi)蒙古鄂爾多斯017000）

聯(lián)合自噬抑制劑增加PI3K／mTOR抑制劑NVP－BEZ235誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡

斯慶圖娜拉

（鄂爾多斯市中心醫(yī)院，內(nèi)蒙古鄂爾多斯017000）

目的探討自噬對I3K／mTOR抑制劑NVP－BEZ235誘導(dǎo)的人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞凋亡的影響。方法PI3K／mTOR抑制劑NVP－BEZ235和（或）自噬抑制劑3－MA處理人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞，MTT法檢測細(xì)胞生存率，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率的變化，Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果 不同濃度的NVP－BEZ235作用于人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞24h后，MTT及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，明顯地抑制了細(xì)胞增殖，并增加了細(xì)胞凋亡率，同時觀測到凋亡相關(guān)蛋白Caspase－3表達(dá)升高；采用3－MA特異性抑制自噬活性后，明顯地增加了NVP－BEZ235誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率；同時，檢測到凋亡相關(guān)蛋白Caspase－3的表達(dá)上調(diào)。結(jié)論 自噬在NVP－BEZ235誘導(dǎo)的人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞凋亡的過程中起保護(hù)作用，3－MA抑制自噬后，促進(jìn)了NVP－BEZ235誘導(dǎo)人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞凋亡，聯(lián)合應(yīng)用PI3K／mTOR抑制劑NVP－BEZ235和自噬抑制劑3－MA有望成為人結(jié)腸癌的新治療策略。

自噬；PI3K／mTOR抑制劑NVP－BEZ235；3－MA；凋亡；人結(jié)腸癌

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1632）

隨著癌癥的發(fā)病率逐年增加，目前結(jié)直腸癌也已逐漸成為了常見的癌癥之一［1］。早期的結(jié)直腸癌患者能夠通過手術(shù)進(jìn)行治療；而大部分結(jié)直腸癌被診斷時已處于晚期階段，因而化療成為輔助外科手術(shù)治療晚期結(jié)直腸癌患者的主要手段［2］。然而，化療對于晚期階段的結(jié)直腸癌治療的效果并不理想，并且逐漸出現(xiàn)化療藥物耐受現(xiàn)象。因此，研究出有效治療結(jié)直腸癌患者的新藥物成為主要的問題。

NVP－BEZ235，是一種新型的PI3K和mTOR的雙重抑制劑，能夠特異性的抑制PI3K和mTOR的活性［3］。最近幾年，在癌癥的研究中，PI3K／AKT／mTOR信號通路已經(jīng)成為的研究的熱點［4］。PI3K／AKT／mTOR信號通路作為許多信號的上游因子，能刺激大量的下游效應(yīng)器活化，因此能夠介導(dǎo)細(xì)胞存活和生長［4］。因此，這個信號的異常的活化在惡性腫瘤中也是常見［5］。PI3K和mTOR除了參與細(xì)胞增殖外，還可以抑制細(xì)胞自體吞噬（autophagy）的發(fā)生［6］；自噬是細(xì)胞的溶酶體降解的通路，它能夠維護(hù)細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，對于細(xì)胞存活的調(diào)控是必要的［7］。自噬的一個關(guān)鍵的調(diào)控因子是mTOR，在生成因子和營養(yǎng)豐富的條件下，mTOR的抑制能夠誘導(dǎo)自噬的發(fā)生［8］。自噬發(fā)揮促存活或者促死亡的作用依賴于環(huán)境條件，因此在癌癥的治療上發(fā)揮了雙刃劍的作用。自噬吞噬的發(fā)生往往對于化療藥物引起的凋亡表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用，因此，聯(lián)合應(yīng)用NVP－BEZ235和自噬抑制劑可能可以明顯的提高NVP－BEZ235引起的結(jié)腸腺癌細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 自噬抑制劑3－MA和噻唑藍(lán)MTT購自美國Sigma公司，PI3K／mTOR抑制劑NVPBEZ235購自LC Laboratories公司，AnnexinV／PI雙染的凋亡試劑盒購于Invitrogen公司，鼠抗人βactin單抗、兔抗人Caspase－3多抗購于Santa Crus公司，ECL顯色液購自Thermo Scientific公司。

1.1.2 細(xì)胞株 人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞株購于美國ATCC細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)于含有100U／ml青霉素和鏈霉素的RPMI－1640＋10%FBS的培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT法檢測細(xì)胞的增殖率 選取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞，以每孔含有8000個細(xì)胞的濃度接種于96孔板，待24h后細(xì)胞完全貼壁，換成含有不同藥物濃度的培養(yǎng)液，每孔200μl，待藥物處理24后，每孔中加入20μl的MTT（5mg／ml），于孵箱中孵育4－6h，選擇酶標(biāo)儀上490nm波長測定各孔的吸光值，計算出細(xì)胞生存率。

1.2.2 流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率 選取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞，以5×105個細(xì)胞／孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后待細(xì)胞貼壁后換含有不同藥物濃度的培養(yǎng)液處理24 h，用胰酶消化貼壁細(xì)胞，收集細(xì)胞，加入適量的AnnexinV／PI溶液，置于室溫，避光孵育15min；使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率，每組實驗重復(fù)進(jìn)行3次。

1.2.3 Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)選取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞，按2×105／孔細(xì)胞接種于75ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后換成含有不用藥物濃度的培養(yǎng)液作用24h后，收獲貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞，離心并用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入RAPI裂解液，提取細(xì)胞中的蛋白，SDS－PAGE膠電泳后，用100V，120min將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶的PBST室溫封閉2h，再加入合適濃度的相應(yīng)一抗，于4℃孵育過夜后，用PBST洗滌3次，15min，5min，5min后，加入相應(yīng)的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫2h，再用PBST洗滌3次，15min，5min，5min后，使用ECL進(jìn)行顯色。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果以x—±s表示，兩組數(shù)據(jù)間的比較采用t檢驗進(jìn)行分析。與對照組相比，實驗組的數(shù)據(jù)以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PI3K／mTOR抑制劑NVP－BEZ235對人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞生存率的影響

0nM、50nM、100nM、200nM的NVPBEZ235干預(yù)DLD1細(xì)胞24h后，MTT結(jié)果顯示，NVP－BEZ235對人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞呈明顯的濃度依賴關(guān)系，對細(xì)胞增殖的抑制作用隨著NVPBEZ235濃度的增加而增強，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴的現(xiàn)象（圖1）。

圖1 PI3K／mTOR抑制劑NVP－BEZ235對人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞生存率的影響

2.2 PI3K／mTOR抑制劑NVP－BEZ235對人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞凋亡率的影響

AnnexinV／PI染色后流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，0 nM、50nM、100nM、200nM的NVP－BEZ235作用于人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞24h后，與對照組相比，細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度的增加而升高，并呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性（圖2）。

圖2 NVP－BEZ235對人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞凋亡的影響

2.3 PI3K／mTOR抑制劑NVP－BEZ235對人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響

0nM、50nM、100nM、200nM的NVPBEZ235處理人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞24h后，與對照組相比，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase－3的表達(dá)隨著藥物濃度的增加而明顯的增高（圖3）。

圖3 NVP－BEZ235對人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞Cleaved Caspase－3的表達(dá)的影響

2.4 自噬抑制劑3－MA增加了NVP－BEZ235對人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞增殖的影響

5mM的3－MA和（或）100nM的PI3K／mTOR抑制劑NVP－BEZ235作用人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞24h后，與對照組相比，3－MA組細(xì)胞的生存率沒有受到明顯的影響，而3－MA和NVPBEZ235的聯(lián)合組細(xì)胞的生存率明顯被抑制，且細(xì)胞的生存率明顯的低于單加NVP－BEZ235組（圖4）。

圖4 抑制自噬劑增加NVP－BEZ235對人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞增殖的抑制

2.5 自噬抑制劑3－MA促進(jìn)了NVP－BEZ235誘導(dǎo)的人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞的凋亡

AnnexinV／PI染色后流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果分析，自噬抑制劑3－MA增加了PI3K／mTOR抑制劑對人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞凋亡的影響。5mM的3－MA和（或）100nM的PI3K／mTOR抑制劑NVPBEZ235作用人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞24h后，與對照組相比，單加3－MA組細(xì)胞凋亡率無明顯差異；而3－MA和NVP－BEZ235聯(lián)合應(yīng)用組細(xì)胞的凋亡率顯著高于單加NVP－BEZ235組（圖5）。

圖5 抑制自噬劑增加NVP－BEZ235引起的人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞凋亡

2.6 3－MA影響了NVP－BEZ235誘導(dǎo)的人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

5mM的3－MA和（或）100nM的PI3K／mTOR抑制劑NVP－BEZ235處理24h后，與對照組相比，3－MA組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)無明顯變化；與單加NVP－BEZ235組比較，3－MA和NVPBEZ235聯(lián)合組Cleaved Caspase－3蛋白的表達(dá)水平明顯增加，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖6）。

圖6 抑制自噬劑增加NVP－BEZ235引起的人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞Cleaved Caspase－3表達(dá)

3 討論

目前，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率仍不斷升高，已成為了世界上最常見的惡性腫瘤之一，而隨著人們生活方式和飲食習(xí)慣的改變，其發(fā)病率居我國惡性腫瘤的第3位，并且每年仍有不斷增加的趨勢。PI3K／Akt是一種主要的存活通路，在許多癌癥中都發(fā)揮重要的作用，包括結(jié)直腸癌［9］。通過靶向PI3K／Akt／mTOR通路在結(jié)直腸癌中已被廣泛的研究。這條通路也是和化療藥物耐受相關(guān)［10］。NVP－BEZ235是一種新的并有前景的PI3K／mTOR抑制劑，它能有效的抑制PI3K和mTOR的活性。最近的研究展示，NVP－BEZ235能夠?qū)I3K3CA突變和未突變的結(jié)直腸癌都有效［11］。因此，NVPBEZ235很快成為了治療結(jié)直腸癌的很有前景的藥物。在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)PI3K／mTOR抑制劑NVP－BEZ235以劑量依賴的方式有效的抑制人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

大量的研究展示，在癌癥細(xì)胞中，PI3K／Akt／mTOR通路的抑制能夠有效的誘導(dǎo)自噬的發(fā)生［12］。報道稱，mTOR通過它的下游基因ULK的磷酸化而成為自噬主要的調(diào)控［13］。所以mTOR的抑制能夠有效的誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。通過PI3K／Akt／mTOR通路誘導(dǎo)的自噬的發(fā)生在一些研究中已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞死亡的機(jī)制有關(guān)，然而也有一些研究展示在藥物耐受中，自噬發(fā)揮了保護(hù)性的作用。在結(jié)直腸癌中，自噬發(fā)揮了保護(hù)性的作用［14］。因此在癌癥細(xì)胞中，抑制自噬能夠有效的增強PI3K／mTOR抑制劑的促凋亡效應(yīng)。在我們的研究中展示，自噬抑制劑3－MA和PI3K／mTOR抑制劑NVP－BEZ235聯(lián)合應(yīng)用時，能夠明顯的增強NVPBEZ235的細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞發(fā)生凋亡，并增加凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase－3的表達(dá)。

因此，PI3K／mTOR抑制劑NVP－BEZ235作為治療癌癥有前景的藥物，能夠有效地誘導(dǎo)人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞發(fā)生凋亡，但是目前其誘導(dǎo)的自噬對癌癥細(xì)胞起到了一定的保護(hù)作用。加入自噬抑制劑3－MA能夠有效的增強NVP－BEZ235對人結(jié)腸腺癌DLD1細(xì)胞的殺傷作用，進(jìn)一步的提高了人結(jié)腸腺癌DLD1對NVP－BEZ235的敏感性。因此，自噬抑制劑3－MA和PI3K／mTOR抑制劑NVPBEZ235的聯(lián)合應(yīng)用成為治療結(jié)直腸癌的潛在有效的治療方案，其臨床療效值得進(jìn)一步研究。

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Inhibition of autophagy enhances dual PI3K／mTOR inhibitor NVP－BEZ235induced apoptosis of human colon adenocarci－noma cell lines

SIQINGTUNALA
.（Erdos Central Hospital of Inner Mongolia，Erdos 017000，China）

ObjectiveTo investigate effects of inhibition of autophagy on NVP－BEZ235－induced apoptosis in human colon adenocarcinoma cell line DLD1.Methods After the DLD1cells were treated with NVP－BEZ235and／or 3－MA，cell viability was detected by an MTT assay.The rate of cell apoptosis was detected using flow cytometry.The expression of apoptosis－related protein were detected by Western blot.Results The cells were treated with varied concentration of NVP－BEZ235for 24h.According to the results of MTT and flow cytometry，the rate of cell proliferation decreased，and the rate of cell apoptosis increased in the dose of NVP－BEZ235.Meanwhile，the expression of apoptosis－related protein，cleaved caspase 3，was increased.However，after autophagy was inhibited by 3－MA，the rate of cell viability was obviously decreased.Meanwhlie，we detected that inhibition of autophagy enhanced the rate of NVP－BEZ235－induced apoptosis and the expression of apoptosis－related protein were obviously increased.Conclusion Autophagy protected human colon adenocarcinoma cell line DLD1from NVP－BEZ235－induced apoptosis.In addition，the blockage of autophagy could enhance NVP－BEZ235－induced apoptosis.The combined therapy of NVP－BEZ235and 3－MA may be a promising therapeutic strategy for human colon adenocarcinoma cell line DLD1.

autophagy；dual PI3K／mTOR inhibitor NVP－BEZ235；3－MA；Apoptosis；human colon adenocarcinoma cell

R735.3＋5

A

斯慶圖娜拉（1979－），女，蒙古族，鄂爾多斯市中心醫(yī)院，博士，研究方向：消化內(nèi)科學(xué)。

2015－03－03）

1007－4287（2015）10－1632－04