周婉君,郝淑賢,吳燕燕,魏 涯,林婉玲,王錦旭,岑劍偉

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,廣東廣州 510300)

鱘龍魚(yú)硫酸軟骨素提取工藝優(yōu)化研究

周婉君,郝淑賢,吳燕燕,魏 涯,林婉玲,王錦旭,岑劍偉*

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,廣東廣州 510300)

利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取西伯利亞鱘龍魚(yú)軟骨組織提取硫酸軟骨素的工藝條件。研究了堿濃度、沉淀時(shí)間、乙醇體積對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn),以堿質(zhì)量濃度、沉淀時(shí)間、乙醇體積為影響因素,以提取率為響應(yīng)值建立二元多次方程,通過(guò)響應(yīng)面分析法得到優(yōu)化組合。結(jié)果表明,最佳工藝條件為:NaOH 0.5mol/L、乙醇體積1倍、沉淀時(shí)間20min,提取得硫酸軟骨素產(chǎn)率為57.21%,預(yù)測(cè)值產(chǎn)率為59.31%。

鱘龍魚(yú),硫酸軟骨素,提取,響應(yīng)曲面法

鱘龍魚(yú)(Acipenser)是淡水類中壽命長(zhǎng)、個(gè)體大、生長(zhǎng)快等養(yǎng)殖優(yōu)點(diǎn)的魚(yú)類,有很高的科學(xué)研究?jī)r(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來(lái),我國(guó)鱘龍魚(yú)的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛并取得了顯著成效[1]。鱘龍魚(yú)骨架為軟骨組織,鱘魚(yú)軟骨與鯊魚(yú)軟骨具有相似功用,內(nèi)含有豐富的抗癌因子——硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate)。硫酸軟骨素是來(lái)自動(dòng)物鼻軟骨、喉軟管及肌腱等軟骨組織,是從動(dòng)物軟骨組織中提取分離得到的一種重要的酸性粘多糖——糖胺聚糖[2]。根據(jù)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)硫酸軟骨素能緩解關(guān)節(jié)炎[3]、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、抗凝血和促進(jìn)骨質(zhì)形成[4],有較好的保水性和黏性、抗腫瘤、抑制病毒活性,因此在醫(yī)藥、保健食品及化妝品行業(yè)有廣泛應(yīng)用[5]。從鱘魚(yú)、鯊魚(yú)中提取硫酸軟骨素優(yōu)化工藝雖然已有多種,但是以西伯利亞成年鱘龍魚(yú)進(jìn)行研究還是極少見(jiàn)。本研究利用西伯利亞成年鱘龍魚(yú)軟骨為原料,為了產(chǎn)品的安全性,通過(guò)工藝技術(shù)研究的改進(jìn)低堿法優(yōu)化提取硫酸軟骨素,應(yīng)用響應(yīng)面分析法(Response Surface Methodolgy)并結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,確定最佳的提取工藝條件,為鱘龍魚(yú)加工副產(chǎn)物高值化利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西伯利亞鱘龍魚(yú)骨:由杭州千島湖鱘龍科技開(kāi)發(fā)有限公司,-18℃凍存;十二水磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉、氫氧化鈉,戊烷磺酸鈉,乙酸,甲醇,異丙醇,均為分析純購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠,乙腈(高級(jí)純)購(gòu)自上海安譜科學(xué)儀器有限公司,胰蛋白酶購(gòu)自廣州市齊云生物技術(shù)有限公司。

Alpha-4冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司;3K30冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;高速萬(wàn)能攪碎機(jī) 上海頂帥有限公司;SCIEN超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;安捷倫1100液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司;GB204電子天平 長(zhǎng)沙湘平科技發(fā)展有限公司;MILLI-Q超純水機(jī) 美國(guó)Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 軟骨預(yù)處理 將鱘魚(yú)軟骨組織置于90℃水浴處理20min,用刀刮除表面的肌肉及脂肪等雜質(zhì),清洗干凈,將軟骨切碎,用50℃烘箱干燥后粉碎機(jī)打碎,密封-18℃保存。

1.2.2 粗提取 參考尚軍等[6]的方法進(jìn)行超聲波水解。稱取5g軟骨粉,50mL磷酸鹽緩沖液,0.015g胰蛋白酶,超聲波水解溫度50℃,功率100%,時(shí)間120min),10000r/min離心15min后取上清液,加入1.0倍體積乙醇和至NaOH 0.4mol/L,攪拌沉淀30min,10000r/min離心20min,取沉淀物用烘箱50℃烘箱干燥約2h。

1.2.3 復(fù)溶 用適量水將上述制得的樣品完全溶解,用40%的乙酸溶液中和,調(diào)pH至中性,冷凍離心機(jī)10000r/min離心20min取上清液,-18℃冷凍干燥機(jī)干燥24h后,取出研碎混勻,得到硫酸軟骨素粗品。

1.3 硫酸軟骨素含量及含量的測(cè)定

參考液相色譜法[7],用乙腈-10mmol/L戊烷磺酸鈉溶液(10∶90),作為流動(dòng)相;流速為1mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為205nm;色譜柱為C18柱,250mm×4.6mm,粒度5μm;進(jìn)樣量20μL。

1.4 硫酸軟骨素產(chǎn)率計(jì)算

根據(jù)硫酸軟骨素含量測(cè)定結(jié)果,計(jì)算硫酸軟骨素含量,計(jì)算公式如下:

硫酸軟骨素產(chǎn)率(%)=硫酸軟骨素粗品質(zhì)量/軟骨質(zhì)量(干重)×100

1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取對(duì)硫酸軟骨素提取有顯著影響的三個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化,即堿液濃度(X1)、沉淀時(shí)間(X2)和乙醇體積(X3)進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),選用三因子Box-Behnken[8]數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels in response surface design

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面分析法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選用三因子根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)的原理,結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定各影響因素的編號(hào)水平。分別為X1堿液濃度(mol/L)、X2沉淀時(shí)間(min)、X3乙醇體積(倍)三個(gè)響應(yīng)變量,產(chǎn)率為響應(yīng)值,響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2[9]。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and results of the response surface

2.2 回歸模型方差分析

根據(jù)表2的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到方差分析結(jié)果見(jiàn)表3[10]。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Variance and error analysis of the response surface

從表3分析結(jié)果可知,回歸模型Pr>F值為0.0084<0.01,說(shuō)明回歸模型與響應(yīng)值的相關(guān)極顯著,模型的相關(guān)系數(shù)為0.9018>0.9,說(shuō)明回歸模型能夠較好地預(yù)測(cè)相應(yīng)的響應(yīng)變量。而失擬項(xiàng)不顯著為0.2182>0.05,該模型在理論上反映了響應(yīng)值的誤差較小,擬合度好。

各因素經(jīng)回歸擬合后,可以得到硫酸軟骨素含量Y對(duì)編碼自變量(堿濃度、沉淀時(shí)間、乙醇體積)的二次多項(xiàng)回歸方程(1):

Y=57.44+5.86X1-1.25X2+2.90X3-0.83X1X2-2.86X1X3+2.64X1X3-7.28X12-0.97X22-5.75X32

由表3可知,堿濃度X1的一次項(xiàng)、堿濃度的X1的二次項(xiàng)及乙醇體積X3的二次項(xiàng)對(duì)硫酸軟骨素含量的影響顯著;堿濃度X1和乙醇體積X3的一次項(xiàng)、三個(gè)因素的一次項(xiàng)、沉淀時(shí)間X2和乙醇體積X3的二次項(xiàng)對(duì)硫酸軟骨素含量影響不顯著。因此,可得到優(yōu)化方程(2):

Y=57.44+5.86X1-7.28X12-5.75X32

2.3 響應(yīng)曲面分析

根據(jù)由擬合的回歸模型作響應(yīng)曲面圖和等高線圖,結(jié)果如圖1～圖3所示。

圖1 沉淀時(shí)間與堿濃度對(duì)產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of precipitation time and alkali concentration on the yield of Chondroitin sulfate

圖2 乙醇體積與堿濃度產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of ethanol and alkali concentration on the yield of Chondroitin sulfate

圖3 乙醇體積與沉淀時(shí)間對(duì)產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of ethanol volume and precipitation time on the yield of Chondroitin sulfate

從圖1可知,當(dāng)乙醇體積定為提取液1倍時(shí),堿濃度的變化對(duì)硫酸軟骨素含量的影響較顯著,隨著堿濃度增加硫酸軟骨素含量先升高后下降。原因是在低濃度堿液中,部分多糖降解不完全或沒(méi)有降解。從圖2可知,乙醇體積和堿濃度的交互作用較小,而堿濃度在0.4～0.6mol/L范圍內(nèi),硫酸軟骨素的含量較大。從圖3可知,乙醇體積和沉淀時(shí)間對(duì)硫酸軟骨素含量的交互作用較強(qiáng),當(dāng)沉淀時(shí)間一定,乙醇體積為0.9～1.1倍左右時(shí),硫酸軟骨素含量較高。

2.4 最佳工藝參數(shù)確定

為了進(jìn)一步得到各因素的最佳條件組合,使得提取硫酸軟骨素含量達(dá)到最佳值,采用Design-Expert軟件對(duì)各因素和響應(yīng)值的數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化分析,以硫酸軟骨素含量為響應(yīng)值,經(jīng)響應(yīng)面分析可得到最佳的提取條件:堿濃度X1=0.49mol/L、沉淀時(shí)間X2=20.36min、乙醇體積X3=0.98倍,硫酸軟骨素含量的預(yù)測(cè)值為59.31%。根據(jù)實(shí)際操作,將預(yù)測(cè)條件修正為堿濃度0.5mol/L、沉淀時(shí)間20min、乙醇體積1倍,并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到硫酸軟骨素產(chǎn)率為57.21%,結(jié)果與理論預(yù)測(cè)值基本相符,對(duì)硫酸軟骨素提取低堿處理參數(shù)具有一定的實(shí)際預(yù)測(cè)價(jià)值。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道郝淑賢[11]、劉安軍[12]、徐傳屯[13]等的提取硫酸軟骨素產(chǎn)率分別是16.65%、35.70%、31.56%,本研究硫酸軟骨素產(chǎn)率結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它實(shí)驗(yàn)結(jié)果,從食品安全方面考慮低濃度堿處理方法較為安全,優(yōu)化工藝條件更有效地提高了硫酸軟骨素的產(chǎn)率和質(zhì)量。

3 結(jié)論

通過(guò)采用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面法建立了3個(gè)影響因素(堿濃度、沉淀時(shí)間及乙醇體積)和響應(yīng)值(產(chǎn)率)結(jié)合相互作用的數(shù)學(xué)模型,得出堿處理時(shí)硫酸軟骨素提取條件的優(yōu)化。三個(gè)因素對(duì)硫酸軟骨素含量的影響順序:NaOH濃度、乙醇體積、沉淀時(shí)間,結(jié)果表明,最佳優(yōu)化工藝條件:NaOH 0.5mol/L、乙醇體積1倍、沉淀時(shí)間20min,按此優(yōu)化工藝條件得到硫酸軟骨素產(chǎn)率為57.21%,建立的數(shù)學(xué)模型能較好地預(yù)測(cè)各實(shí)驗(yàn)因素和考察指標(biāo)之間的關(guān)系。

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Optimization technology of extractionof the chondroitin sulfate from sturgeon

ZHOU Wan-jun,HAO Shu-xian,WU Yan-yan,WEI Ya,LIN Wan-ling,WANG Jin-xu,CEN Jian-wei*

(South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Key Laboratoryof Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture,National R&D Centerfor Aquatic Product Processing,Guangzhou 510300,China)

Extraction of the chondroitin sulfate in sturgeon was studied by response surface methodology. The influence of alkalinity,sedimentation time,ethanol volume on extract rate of chondroitin sulfate was studied. On the basis of single-factor investigation,Box-Benhnken central composite experiments were carried out to build the quadratic regression model for the extraction yield with above 3 factors,the optimizing process parameters were:alkalinity 0.5mol/L,sedimentation time 20min,ethanol volume 1 times of the extraction solution. Under the optimal processing condition,the yield of chondroitin sulfate was 57.21%,and the forecasted yield was 59.31%.

sturgeon;chondroitin sulfate;extraction;response surface methodology

2015-01-15

周婉君(1961-)，女，本科，實(shí)驗(yàn)師，主要從事水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全控制技術(shù)方面的研究。

*通訊作者:岑劍偉(1976-)，男，碩士，副研究員,主要從事水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全控制技術(shù)方面的研究。

國(guó)家公益性(農(nóng)業(yè))行業(yè)專項(xiàng)(201003055-06)；國(guó)家重大科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(ZD-2013-345-3)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2012YD01)。

TS254.9

B

1002-0306(2015)13-0209-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.035