孫 霞,鞏 洋,楊 勇,楊 敏,卿丹丹,李躍文,李 靜,何 利,李 誠,胡 濱

(四川農業(yè)大學食品學院,四川雅安 625014)

接種混合發(fā)酵劑生產的低酸度川味香腸加工過程中的蛋白質降解

孫 霞,鞏 洋,楊 勇*,楊 敏,卿丹丹,李躍文,李 靜,何 利,李 誠,胡 濱

(四川農業(yè)大學食品學院,四川雅安 625014)

接種發(fā)酵劑并在控溫控濕條件下生產低酸度川味香腸,對蛋白質降解情況進行研究,并與自然條件下生產的傳統(tǒng)川味香腸(對照組)相比較,揭示低酸度川味香腸加工過程中蛋白質變化規(guī)律。結果顯示:干燥結束時,低酸度川味香腸的總氮、非蛋白氮和氨基酸態(tài)氮分別為4.40%、0.426%和0.366%,均高于對照組;低酸度川味香腸的游離氨基酸總量為605.06mg/100g,高于對照組的497.47mg/100g(p<0.01);肌漿蛋白和肌原纖維蛋白在成熟過程中逐漸降解,大分子條帶在干燥過程中發(fā)生了明顯降解(p<0.05),低酸度川味香腸的蛋白質降解更為顯著(p<0.05)。

低酸度川味香腸,蛋白質降解,游離氨基酸,肌漿蛋白,肌原纖維蛋白

川味香腸是我國特色的傳統(tǒng)腌臘肉制品,因其香氣濃郁、風味獨特、麻辣爽口而深受消費者的喜愛。低酸度川味香腸一般通過接種發(fā)酵劑,利用現(xiàn)代控溫控濕工藝使香腸pH達到5.50以上[1]。在香腸的發(fā)酵、成熟和干燥過程中,肌肉蛋白降解是發(fā)酵香腸加工過程中重要的生化反應,蛋白質降解后形成的多種低分子量的化合物如氨基酸、肽類、醛類和有機酸等是重要的風味物質,對發(fā)酵香腸的風味有重要影響[2]。

目前,國內外學者已對發(fā)酵香腸加工過程中蛋白質降解及其降解產物進行了系統(tǒng)的研究。Frederic等[3]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵香腸中蛋白質的降解產物肽,在氨肽酶的作用下降解為游離氨基酸。Casaburi等[4]發(fā)現(xiàn)肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的降解成分為肽、游離氨基酸這些成分是發(fā)酵香腸風味物質的重要來源,其中寡肽、游離氨基酸仍會進一步的酶解和化學反應。Careri等[5]研究發(fā)現(xiàn)蛋白質降解雖然有利于發(fā)酵香腸風味的形成,但是若過度降解(高于30%),則產生不愉快的口味如苦味和金屬味。張雪梅[6]對四川傳統(tǒng)發(fā)酵香腸在加工過程中蛋白質的降解規(guī)律進行了研究,發(fā)現(xiàn)未檢測到天冬氨酸、絲氨酸和胱氨酸,其余的各種氨基酸含量相對于原料肉都有不同程度的增加,其中丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸含量最高。帥瑾[7]通過接種植物乳桿菌和葡萄球菌生產川式薩拉米香腸,發(fā)現(xiàn)必需氨基酸總量比自然發(fā)酵組提高38.45%,游離氨基酸總量比自然發(fā)酵組提高21.32%,但是產品pH為4.63,口感較酸,與傳統(tǒng)四川香腸的口感差異很大。目前關于低酸度川味香腸在加工過程中蛋白質降解情況的研究鮮有報道。

本研究通過以植物乳桿菌、戊糖片球菌、葡萄球菌作為發(fā)酵劑,采用控溫控濕現(xiàn)代工藝對低酸度川味香腸在加工過程中總氮、非蛋白氮、氨基酸態(tài)氮、游離氨基酸、肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的變化情況進行研究,以期為提高低酸度川味香腸的品質提供初步的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄球菌(Staphylococcus)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和戊糖片球菌(Pediocossuspentosaceus) 均由四川農業(yè)大學肉品研究室從傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸中分離得到[7-8]；新鮮豬后腿肉、腸衣、辣椒、花椒和食鹽等調味料 均購于四川雅安農貿市場；考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白、過硫酸銨、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、四甲基乙二胺 均為Sigma公司產品;溴酚藍、三氯乙酸、甘油、碘化鉀、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、氫氧化鈉 以上試劑均為分析純。

LHS-250SC恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海榮豐科學儀器有限公司;ST16R高速冷凍離心機 北京博儀恒業(yè)科技發(fā)展有限公司;TS-2000A型搖床 海門市麒麟醫(yī)用儀器廠;HWS24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒公司;721分光光度計 上海第三分析儀器廠;日立L-8900氨基酸自動分析儀 日本;DYY-6D電泳儀 DYC2-24DN電泳槽 北京六一儀器廠;Gel-Doc-XR+凝膠成像儀 BIO-RAD。

1.2 低酸度川味香腸的制作

參照張雪梅[6]的配方:豬肉100kg(皮下脂肪20kg,瘦肉80kg),食鹽2.5kg,辣椒粉1.0kg,花椒粉0.4kg,白砂糖1.0kg,味精0.15kg,白酒1.0kg,十三香0.05kg,NaNO30.025kg,NaNO20.0075kg。

采用現(xiàn)代控溫控濕工藝制作。工藝流程:原料肉→預處理→絞碎→添加配料→接種→混合→灌腸→發(fā)酵→成熟→干燥→成品

發(fā)酵劑的制作:30℃條件下液體培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選菌株14h后,置于4℃條件下4000r/min冷凍離心10min,用無菌生理鹽水洗滌一次再離心,收集菌體并適量稀釋,運用血球計數(shù)法計數(shù),接種量為106cfu/g,植物乳桿菌、戊糖片球菌和葡萄球菌按1∶1∶1的比例混合加入肉料中。

本研究在預實驗、單因素實驗、正交實驗的基礎上,確定低酸度川味香腸(pH為5.50)的工藝參數(shù):發(fā)酵溫度20℃,發(fā)酵相對濕度75%,發(fā)酵時間12h,葡萄糖添加量0.10%;成熟溫度13℃,成熟相對濕度60%,成熟時間4d;干燥溫度55℃,干燥時間24h。實驗組是接種混合發(fā)酵劑并在控溫控濕條件下生產的低酸度川味香腸,對照組是不接種發(fā)酵劑在自然條件下生產的傳統(tǒng)川味發(fā)酵香腸。

1.3 樣品采集

取川味香腸在加工過程中的7個工藝點,0h(原料肉)、12h(發(fā)酵結束)、36h(成熟1d)、60h(成熟2d)、84h(成熟3d)、108h(成熟4d)、132h(干燥結束)的香腸作為指標測定樣品。

1.4 實驗方法

1.4.1 總氮測定 稱取絞碎的香腸樣品1.5g于消化管中,參照GB/T5009.5-2010的半微量凱氏定氮法測定總氮含量[6]。

1.4.2 非蛋白氮測定 稱取絞碎香腸樣品10g于三角瓶中,加入90mL蒸餾水,振搖40min,取25mL濾液,并加入25mL 10%三氯乙酸溶液,過濾后取10mL濾液消化,參照GB/T5009.5-2010的半微量凱氏定氮法測定非蛋白氮含量。

1.4.3 氨基酸態(tài)氮測定 采用甲醛滴定法進行測定[6]。

1.4.4 游離氨基酸測定 參照程燕等[9]的方法:精確稱取香腸樣品5.000g,加入25mL 10%的磺基水楊酸,置于4℃冰箱中沉淀2h,吸取上清液冷凍離心(10000r/min,4℃,15min),經紗布過濾后用旋轉蒸發(fā)儀濃縮干燥,加入去離子水再濃縮干燥(重復操作一次),然后用0.02mol/L鹽酸定容至10mL,用超濾膜過濾后取20μL濾液用氨基酸分析儀測定。

1.4.5 肌漿蛋白與肌原纖維蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳 肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的提取參照Doerscher等[10]和Molina等[11]的方法。樣品處理方法和電泳參數(shù)參照汪家政等[12]和郭堯君[13]的方法,選分離膠濃度為12%,濃縮膠濃度為4%進行電泳。

1.5 數(shù)據處理與統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據為三次統(tǒng)計的平均值,使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件描述性分析和方差分析程序進行處理,并進行多重比較(p<0.05)。

2 結果與討論

2.1 低酸度川味香腸加工過程中總氮的變化

由圖1可知,總氮初始含量為3.6%,在發(fā)酵結束,實驗組和對照組的總氮含量均呈下降趨勢(p<0.05),實驗組總氮含量下降速度大于對照組,這可能是由于實驗組發(fā)酵溫度高,水分散失程度大,導致水溶性蛋白質隨著鹽水的滲出而流失。在成熟期,實驗組和對照組的總氮含量呈明顯的上升趨勢(p<0.01),且實驗組總氮含量高于對照組,一方面可能是由于實驗組接種了乳酸菌和葡萄球菌,促進蛋白質降解為游離氨基酸、小分子肽以及部分風味成分[14];另一方面可能是由于此階段實驗組的pH逐漸下降并維持在5.50～5.70,此條件下組織蛋白酶活性增強。在干燥期,實驗組和對照組的總氮含量均呈緩慢的下降趨勢(p<0.05),最終含量分別達到4.40%和4.09%,這可能是由于高溫促使水分大量散失,食鹽濃度增大,組織蛋白酶活性受到抑制,從而使蛋白質降解變慢,這與呂舒[15]等對傳統(tǒng)發(fā)酵四川香腸的研究結果是一致的。

圖1 低酸度川味香腸加工過程中總氮的變化Fig.1 Changes of total nitrogen in low acidity Sichuan-style sausage during processing

2.2 低酸度川味香腸加工過程中非蛋白氮的變化

非蛋白氮含量是指除了蛋白質以外的所有游離氨基酸、多肽和短肽的總含量。非蛋白氮是表征蛋白質降解的一個重要指標,是川味香腸產生風味的重要前提物質。由圖2可知,川味香腸在整個加工過程中,實驗組和對照組的非蛋白氮含量呈逐漸上升趨勢(p<0.05),這是因為組織蛋白酶等對蛋白質的降解作用貫穿于川味香腸加工的整個過程,其降解產生的游離氨基酸和肽類物質不斷積累,促使非蛋白氮含量持續(xù)上升,這與Soriano[16]等的研究結相似。在發(fā)酵期,實驗組非蛋白氮含量上升速度大于對照組(p<0.01),這可能是由于實驗組接種發(fā)酵劑且發(fā)酵溫度較高,發(fā)酵劑在適宜條件下產生降解蛋白的酶,高溫促使組織蛋白酶和寡肽酶的活性增強,使蛋白質水解產生游離氨基酸和肽類物質,這與朝鮮娜[17]等研究發(fā)酵劑對熏馬腸成熟過程中蛋白質降解的影響結果是相似的。在成熟期,實驗組和對照組的非蛋白氮含量呈緩慢上升的趨勢,一方面可能是由于成熟溫度的降低抑制了組織蛋白酶活性和微生物活性;另一方面也可能是由于水分不斷減少,高濃度食鹽抑制了組織蛋白酶活性,從而使蛋白質降解變慢。在干燥期,實驗組和對照組的非蛋白氮含量呈緩慢上升的趨勢,最終含量分別為0.426%和0.215%,這可能是由于較高的干燥溫度使食鹽含量降低,微生物活動增強,使非蛋白氮含量升高。

圖2 低酸度川味香腸加工過程中非蛋白氮的變化Fig.2 Changes of non-protein nitrogen in low acidity Sichuan-style sausage during processing

2.3 低酸度川味香腸加工過程中氨基酸態(tài)氮的變化

由圖3可知,在川味香腸整個加工過程中,氨基酸態(tài)氮呈上升趨勢(p<0.05)。在發(fā)酵結束,實驗組氨基酸態(tài)氮含量明顯高于對照組(p<0.01),這可能是由于實驗組接種了發(fā)酵劑,微生物在較高的發(fā)酵溫度下產生的蛋白酶分解肌原纖維蛋白從而促進蛋白質的降解,使香腸中氨基酸態(tài)氮含量提高。在成熟期,實驗組和對照組的氨基酸態(tài)氮變化不顯著(p>0.05),這可能是由于成熟溫度較低,抑制了微生物活動和組織蛋白酶活性使蛋白質降解作用減少,此外部分的氨基酸態(tài)氮參與了川味香腸風味的形成,自身被消耗。在干燥期,實驗組和對照的氨基酸態(tài)氮含量迅速上升(p<0.01),這可能是因為干燥期水分含量降低,使氨基酸態(tài)氮相對濃度增大,也可能是因為水分散失導致食鹽含量增加,蛋白質結構遭到破壞,使蛋白酶更易作用于蛋白質[18]。最終實驗組和對照組氨基酸態(tài)氮分別為0.366%和0.185%,實驗組高于對照組,可能是因為實驗組的pH在5.50左右,此時的酸性環(huán)境使蛋白質變性,實驗組水分散失量和食鹽含量均大于對照組,實驗組中的蛋白酶更易作用于蛋白質,從而使氨基酸態(tài)氮含量高于對照組。

圖3 低酸度川味香腸加工過程中氨基酸態(tài)氮的變化Fig.3 Changes of amino acidic nitrogen in low acidity Sichuan-style sausage during processing

2.4 低酸度川味香腸加工過程中游離氨基酸的變化

由表1可知,除Cys外,低酸度川味香腸加工結束時的其余各種游離氨基酸含量與原料肉相比有明顯的增加(p<0.05),這與國內外有關發(fā)酵香腸的研究報道相似[19-21]。經過發(fā)酵,除Ser、Gly、Ala、Cys和Leu含量下降外,其余各種氨基酸含量呈整體上升趨勢,實驗組發(fā)酵結束后游離氨基酸的總量比原料肉中游離氨基酸總量提高81.0%,對照組發(fā)酵結束后游離氨基酸的總量比原料肉中游離氨基酸總量提高66.2%,且實驗組比對照組高8.4%,說明接種的發(fā)酵劑促進了原料肉中蛋白質降解,產生游離氨基酸,這與Candogan等[22]的研究結果一致。低溫成熟階段,Asp、Ser、Glu、Gly、Ala、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Arg和Pro都有所增加,成熟結束后實驗組的游離氨基酸總量比對照組提高13%,這可能是由于實驗組pH在5.50～5.70之間,有利于蛋白酶作用于蛋白質,使蛋白質降解產生游離氨基酸。干燥結束后,實驗組的游離氨基酸總量為605.06mg/100g,明顯高于對照組的497.47mg/100g(p<0.01),這說明接種的發(fā)酵劑促進了蛋白質的降解;實驗組的游離氨基酸總量是成熟結束后的1.95倍,對照組的游離氨基酸總量是成熟結束后的1.81倍,這說明較高的干燥溫度促進了蛋白質降解,產生更多的游離氨基酸。

表1 低酸度川味香腸加工過程中游離氨基酸的變化(干基mg/100g)Table 1 Changes of free amino acids in low acidity Sichuan-style sausage during processing(mg/100g)

注:表中數(shù)據為均值±標準差;同行均值有共同上標字母者表示差異不顯著(p>0.05)。

最終實驗組游離氨基酸總量的比對照組提高21.6%,實驗組的必需氨基酸(Lys、Phe、Met、Ile、Thr、Leu、Val)總量比對照組提高31.5%。在整個加工過程中,含量較高的游離氨基酸有蘇氨酸、谷氨酸、丙氨酸等,其余各種游離氨基酸的含量都超過其成為閾值,對發(fā)酵香腸滋味的形成十分重要[23]。胱氨酸含量變化不顯著(p>0.05),這是因為胱氨酸是半胱氨酸的氧化形式,而胱氨酸具有活潑的硫氫基,易于參加氧化反應過程失去氨基酸特性,這與趙改名[24]的研究結果相似。

2.5 低酸度川味香腸加工過程中肌肉蛋白質的降解變化

2.5.1 肌漿蛋白的降解變化 由圖4可知,在低酸度川味香腸整個加工過程中,實驗組的肌漿蛋白條帶發(fā)生了明顯變化,分子量為157ku(f1)、97.2ku(f2)、44.3ku(f4)、29.0ku(f5)、23ku(h1)、14.3ku(h2)的蛋白條帶從發(fā)酵期到干燥期就逐漸變弱甚至消失,說明在加工階段發(fā)生了降解;對照組各階段變化不明顯,只有分子量在97.2ku(f2)、44.3～66.4ku附近的蛋白條帶干燥期變弱甚至消失。

在發(fā)酵期,實驗組肌漿蛋白的分子量在97.2ku(f2)的蛋白條帶顏色略微變弱,而對照組的蛋白條帶基本無變化,這可能是由于實驗組接種了發(fā)酵劑并且發(fā)酵溫度較高,微生物產生的蛋白酶作用,這與Mauriello等[25]的研究結果相似。在成熟期,實驗組肌漿蛋白的分子量在157ku(f1)、97.2ku(f2)、44.3ku(f4)、29.0ku(f5)、23ku(h1)、14.3ku(h2)的蛋白條帶逐漸變弱,在成熟到第4d部分蛋白發(fā)生了明顯的降解,生成了一些分子量較小的片段,這些片段通過其它的生化反應,生成了低酸度香腸的風味和滋味物質[26],這可能是由于實驗組接種了發(fā)酵劑并在成熟后期香腸的pH在5.50～5.70之間,此時組織蛋白酶活性較高,也可能是由于在低酸性環(huán)境下蛋白質變性,蛋白酶更易作用于蛋白質,從而使大分子的蛋白條帶發(fā)生了部分降解,這與Casaburi等[27]的研究結果相似;而對照組肌漿蛋白的條帶變化不明顯,降解程度非常小,這可能是由于自然環(huán)境下較低的溫度抑制了蛋白酶的活性。

在干燥期,實驗組肌漿蛋白的分子量在157ku(f1)、97ku(f2)的蛋白條帶消失,發(fā)生了明顯的降解,而對照組肌漿蛋白的條帶是由粗變細,這可能是由于實驗組香腸的pH在5.50～5.70,使蛋白質變性,再加上干燥期較高的干燥溫度使水分大量散失,導致食鹽含量增加,蛋白質結構遭到破壞,蛋白酶更易作用于蛋白質,從而使大分子量的蛋白發(fā)生降解;實驗組和對照組肌漿蛋白的分子量在66.4ku(f3)、29.0～44.3ku之間的蛋白條帶變粗,這可能是由于較高的干燥溫度使小分子量的蛋白發(fā)生了聚合[28],從而使此分子量的蛋白條帶變粗。

圖4 低酸度川味香腸加工過程中肌漿蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE of sarcoplasmic proteins in low acidity Sichuan-style sausage during processing注:M-標準蛋白;1-原料肉;2-發(fā)酵結束;3-成熟1d;4-成熟2d;5-成熟3d;6-成熟4d;7-干燥結束,圖5同。

圖5 低酸度川味香腸加工過程中肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.5 SDS-PAGE of myofibrillar proteins in low acidity Sichuan-style sausage during processing

2.5.2 肌原纖維蛋白的降解變化 由圖5可知,在低酸度川味香腸整個加工過程中,對照組肌原纖維蛋白的條帶變化不明顯,實驗組與對照組相比,肌原纖維蛋白發(fā)生了一定的降解,隨著加工的進行,實驗組低分子量的蛋白條帶越來越少,尤其是14.3ku(h2)附近的條帶明顯變弱;分子量在44.3ku的蛋白條帶在整個加工過程中幾乎沒發(fā)生降解,這與王振宇等[28]的研究結果相似。

在發(fā)酵期,實驗組肌原纖維蛋白的分子量在200ku(f1)的蛋白條帶明顯變細,對照組蛋白條帶變化較小,這可能是由于實驗組接種發(fā)酵劑,微生物產生了蛋白酶并在較高的發(fā)酵溫度下使大分子量的蛋白降解。在成熟期,實驗組肌原纖維蛋白的分子量在52ku(f3)、24ku(f5)、18ku(h1)、14.3ku(h2)的蛋白條帶逐漸變淺且比對照組蛋白條帶變化明顯,此階段肌原纖維蛋白片段緩慢降解,生成了一些新的條帶,但降解作用并不劇烈,這可能是由于成熟溫度較低,抑制了組織蛋白酶活性,蛋白降解緩慢,但在成熟的整個過程來看,蛋白質的降解作用仍在繼續(xù)進行。

在干燥期,實驗組和對照組肌原纖維蛋白的分子量在200ku(f1)、97.2ku(f2)、24ku(f5)、18ku(h1)、14.3ku(h2)的蛋白條帶變淺變細,蛋白質發(fā)生了明顯降解,并且實驗組比對照組降解的更加劇烈,這可能是由于實驗組香腸的酸性環(huán)境使蛋白質變性,蛋白酶更易作用于蛋白質;而分子量在29.0～44.3ku之間的部分條帶和分子量為52ku(f3)的蛋白條帶變粗,這可能是由于較高的干燥溫度使小分子量的蛋白發(fā)生聚合。

3 結論

采用控溫控濕工藝及接種發(fā)酵劑生產的低酸度川味香腸(實驗組)和自然條件下生產的傳統(tǒng)川味香腸(對照組)在加工過程中非蛋白氮、氨基酸態(tài)含量差異顯著(p<0.05)。低酸度川味香腸在整個加工過程中,非蛋白氮和氨基酸態(tài)氮顯著上升(p<0.01),實驗組分別為0.426%和0.366%,均高于對照組的0.215%和0.185%,說明實驗組接種的發(fā)酵劑和較高的發(fā)酵溫度共同促進了蛋白質的降解。總氮在加工過程中呈先降低后升高再下降的趨勢,但整體變化都比較平緩,最終實驗組和對照組的含量分別達到4.40%和4.09%。隨著加工工藝的進行,蛋白質降解加劇,最終實驗組和對照組的游離氨基酸總量分別達到605.06mg/100g和497.47mg/100g。從SDS-PAGE電泳圖譜可以看出,肌漿蛋白和肌原纖維蛋白在成熟過程中逐漸降解,大分子條帶在干燥過程中發(fā)生明顯降解,且實驗組的蛋白質降解比對照組更明顯。

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Protein degradation of low acidity Sichuan-stylesausage inoculated mixed strains during processing

SUN Xia,GONG Yang,YANG Yong*,YANG Min,QING Dan-dan,LI Yue-wen,LI Jing,HE Li,LI Cheng,HU Bin

(College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China)

The low acidity Sichuan-style sausage was processed with inoculated starter under controlling temperature and humidity,compared with traditional Sichuan-style natural fermentation sausage(control group)to verify the protein change during processing. The results showed that total nitrogen,non-protein nitrogen and amino acidic nitrogen were 4.40%,0.426% and 0.366%,respectively,which were higher than control group at the end of drying. The content of all free amino acid of low acidity Sichuan-style sausage was 605.06mg/100g(p<0.01),which was higher than control group(497.47mg/100g)at the end of drying. The sarcoplasmic protein and myofibrillar protein were degraded gradually during ripening,and the protein of molecular weight greater were degraded obviously(p<0.05).The protein of low acidity Sichuan-style sausage was degraded significantly during processing compared with control group(p<0.05).

low acidity Sichuan-style sausage;protein degradation;free amino acid;sarcoplasmic protein;myofibrillar protein

2014-11-05

孫霞(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：肉品科學與技術。

*通訊作者:楊勇(1969-)，男，博士，教授，研究方向：肉品科學與技術。

四川省科技廳成果轉化項目(2013NC0052)。

TS251.65

A

1002-0306(2015)13-0066-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.005