孫燕，張樹(shù)卓，卓仁恭，劉曉燕，馬曉蕓，魏曉莉，劉瑩，鄭建全

1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬一院 心內(nèi)科，遼寧 大連 116000；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 毒物藥物研究所,北京 100850；

3.南方醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510515

HCN通道（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel）即超極化激活的環(huán)核苷酸門控陽(yáng)離子通道，是一種超極化激活的內(nèi)向陽(yáng)離子電流，至今共發(fā)現(xiàn)4個(gè)亞基，分別為HCN1、HCN2、HCN3和HCN4[1-4]。HCN通道是電壓門控陽(yáng)離子通道成員，在結(jié)構(gòu)上類似電壓依賴性通道，但不同的HCN亞型通道的mRNA的表達(dá)水平和分布情況卻并不完全相同[2-3]。HCN2在大腦中廣泛表達(dá)；HCN1和HCN4分布比較局限，僅在特定的大腦區(qū)域表達(dá)量高，HCN1主要在新皮質(zhì)、海馬、小腦皮質(zhì)表達(dá)，HCN4主要在內(nèi)側(cè)韁核、丘腦、嗅球、基底神經(jīng)節(jié)的某些特定神經(jīng)元表達(dá)；HCN3在大腦的大部分區(qū)域的表達(dá)量低，但在嗅球和下丘腦的一些核團(tuán)表達(dá)量較高[1,5-6]。HCN主要的生物學(xué)功能包括調(diào)節(jié)心臟起搏，調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性及節(jié)律性活動(dòng)，維持靜息膜電位及神經(jīng)元放電的共振，影響神經(jīng)元的突觸可塑性及突觸傳遞[3,7]。HCN通道與一些疾病密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，HCN2的缺失可以出現(xiàn)竇性心律失常和癲癇；HCN1的缺失可以出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)學(xué)習(xí)和記憶的障礙；HCN4的突變可表現(xiàn)為家族性竇性心動(dòng)過(guò)緩、心律失常、心力衰竭等[1,8]。在體內(nèi)，HCN通道為異聚體，其在不同腦區(qū)的生物學(xué)功能尚未完全明確。為此，我們建立了爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)的HCN1及HCN2通道的同聚體模型，以觀察HCN通道同聚體電流的生物學(xué)特點(diǎn)，為HCN通道性質(zhì)的研究及藥物評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

攜帶HCN1、HCN2編碼序列的質(zhì)粒由Colum?bia University的Steven A.Siegelbaum教授提供，表達(dá)載體為pGH19[9]；大腸桿菌TOP10轉(zhuǎn)化態(tài)細(xì)胞購(gòu)自博邁德公司；質(zhì)粒提取及互補(bǔ)DNA（cDNA）體外轉(zhuǎn)錄試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶NheⅠ、SpeⅠ均為TaKaRa公司產(chǎn)品；青霉素、鏈霉素均購(gòu)自北京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 記錄及培養(yǎng)外液的配制

OR-2溶液（mmol/L）：NaCl 82，KCl 2.5，MgCl2·6H2O 1，HEPES 5（用 NaOH 調(diào) pH 值至 7.6）；ND-96溶液（mmol/L）：NaCl 96，KCl 2，CaCl21.8，MgCl2·6H2O 1，HEPES 5（用NaOH調(diào)pH值至7.6）；記錄外液（mmol/L）：KCl 96，NaCl 2，MgCl22，HEPES 10（用KOH調(diào)pH值至7.5）。

1.3 互補(bǔ)RNA（cRNA）的制備

將含有HCN基因的表達(dá)載體pGH19轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，涂于含有氨芐西林（100 μg/mL）的固體LB培養(yǎng)基平板上，倒置平板，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，挑選單克隆置于液體LB培養(yǎng)基中，250 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h，提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定正確后，送測(cè)序公司測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果與Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)完成正確。取HCN1和HCN2的cDNA 20～40 μg，分別用NheⅠ、SpeⅠ線性化2 h，經(jīng)DNA純化和去RNA酶，用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成cRNA，并進(jìn)行RNA純化，純化后的cRNA存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 爪蟾卵母細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

從低溫麻醉的成年雌性爪蟾中取出Ⅴ、Ⅵ期成熟卵母細(xì)胞，置于含有膠原酶的OR-2溶液中，消化至無(wú)纖維組織及毛細(xì)血管殘留的單個(gè)細(xì)胞為止；除去消化液，用含有雙抗的OR-2清洗5～6次，置于含有雙抗及5%馬血清的ND-96培養(yǎng)皿中，挑選外形較圓、色澤清晰、有一定張力、表面光滑的細(xì)胞注入cRNA（HCN1 5.5 ng，HCN2 2.8 ng，HCN1+HCN2混合分別為2.8 ng+1.4 ng），孵育在生化培養(yǎng)箱（18～22℃）中，1～3 d后可用于電生理記錄。

1.5 電生理學(xué)

雙電極電壓鉗記錄電流時(shí)采用Axoclamp-2B放大器，記錄時(shí)室內(nèi)溫度保持在23～25℃。采用Sutter Instrument公司的P-97型微電極儀拉制記錄玻璃微電極，微電極的尖端開(kāi)口在1～3 mm，電極內(nèi)液為3 mol/L KCl，電極電阻為0.3～3 MΩ。電流記錄采用episode模式，采樣頻率10 kHz，鉗制電位為-50 mV并以10 mV為步階遞減至-140 mV給予細(xì)胞刺激。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用 Clampfit 10.2軟件（Axon Instruments）獲取電流數(shù)據(jù)，用OriginPro 8軟件處理繪制圖形。數(shù)據(jù)分析使用x±s，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，SPSS軟件分析數(shù)據(jù)，P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 HCN1與HCN2同聚體在爪蟾卵母細(xì)胞中的功能表達(dá)

采用雙電極電壓鉗技術(shù)記錄了在爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)的HCN通道電流，1 mmol/L的CsCl可以有效阻斷這種超極化激活的內(nèi)向陽(yáng)離子電流[5，10-11]。圖1、2中分別記錄了HCN1、HCN2電流，對(duì)照組及CsCl阻斷前后及其電流-電壓（I-V）曲線。無(wú)CsCl時(shí)，使細(xì)胞膜超極化至-140 mV時(shí)，誘發(fā)的HCN1電流幅度為-4829±357.7 nA（n=5，圖1B）；添加1 mmol/L的CsCl后6 min，其電流減小到-698.5±366 nA（n=5，圖1C）；沖洗 15 min后，其電流值恢復(fù)至-2140.2±726.6 nA（n=5，圖 1D）；圖 1E 示 3種不同情況下HCN1通道的I-V曲線。無(wú)CsCl時(shí)HCN2的電流幅度為-1397.9±664.0 nA（n=4，圖2A）；添加1 mmol/L的CsCl后6 min，其電流值幾乎完全被抑制（n=4，圖2B）；沖洗10 min后，其電流值為-1037.6±580.3 nA（n=4，圖2C），在1 mmol/L的CsCl作用下，HCN2電流值顯著減少；圖2D示3種不同情況下HCN2通道的I-V曲線。由圖可知，HCN1激活較快，而HCN2的激活動(dòng)力學(xué)較慢。

2.2 HCN1與HCN2異聚體在爪蟾卵母細(xì)胞中的功能表達(dá)

HCN1與HCN2為不同的亞基，那么HCN1與HCN2結(jié)合后電流數(shù)值有什么變化呢？HCN1組每個(gè)細(xì)胞注入HCN1的cRNA 5.5 ng，其電流值為-4289±357.7 nA（n=5，圖5A），HCN2組每個(gè)細(xì)胞注入HCN2 的 cRNA 2.8 ng，其電流值為-1397.9±664.0 nA（n=3，圖4B），HCN1+HCN2組每個(gè)細(xì)胞混合注入HCN1的cRNA 2.8 ng、HCN2的cRNA 1.4 ng，其電流值為-9471.6±1813.7 nA（n=4，圖 3C）；圖3D為3種不同狀態(tài)下的I-V曲線。

3 討論

HCN通道在維持神經(jīng)元的靜息膜電位及神經(jīng)元的節(jié)律性活動(dòng)等生理過(guò)程中起重要作用。HCN通道的改變可能會(huì)導(dǎo)致心律失常、癲癇等疾病的發(fā)生[12]。本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)建立爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)的HCN1及HCN2通道的同聚體細(xì)胞模型，觀察1 mmol/L的CsCl對(duì) HCN1、HCN2的作用；并建立了HCN1及HCN2共表達(dá)的異源多聚體模型，觀察共表達(dá)的異源多聚體通道產(chǎn)生的電流。在目前的實(shí)驗(yàn)中，我們已驗(yàn)證了CsCl對(duì)HCN1及HCN2的阻斷作用，與以往文獻(xiàn)報(bào)道相符[10-11,13]，1 mmol/L的CsCl可以有效抑制Ih電流，說(shuō)明本研究中HCN通道表達(dá)模型建立成功。HCN1與HCN2混合形成了新的異源多聚體通道，該通道具有新的性質(zhì)，而這些特性不能從單個(gè)通道組成簡(jiǎn)單推論而來(lái)。實(shí)驗(yàn)證明，新的異源多聚體通道產(chǎn)生的電流比單獨(dú)HCN1、HCN2亞基產(chǎn)生的電流大，其通道的激活動(dòng)力學(xué)及電壓依賴性處于HCN1和HCN2之間，且更接近HCN1亞單位的特性[6]。在海馬CA1區(qū)，HCN1及HCN2形成的異聚體通道共同表達(dá)形成Ih電流，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外模擬該通道并研究其性質(zhì)，有助于我們研究天然通道的獨(dú)特性質(zhì)。近年來(lái)HCN通道已引起許多研究者的注意，期望通過(guò)對(duì)該通道的探討，為研究HCN通道相關(guān)疾病提供新的理論依據(jù)[1]。本試驗(yàn)建立的細(xì)胞模型可作為研究HCN通道在疾病發(fā)生機(jī)制中的作用的便利模型，同時(shí)也是今后藥物評(píng)價(jià)的可靠依據(jù)。

圖1 HCN1在爪蟾卵母細(xì)胞中的表達(dá)A：記錄HCN1電流的刺激脈沖；B：HCN1電流；C：1 mmol/L CsCl阻斷HCN1；D：沖洗15 min后記錄的HCN1電流；E：記錄HCN1電流的I-V曲線

圖2 HCN2在爪蟾卵母細(xì)胞中的表達(dá)A：HCN2電流；B：1 mmol/L CsCl阻斷HCN2；C：沖洗10 min后記錄的HCN2電流；D：記錄HCN2電流的I-V曲線

圖3 HCN通道同聚體及異聚體在爪蟾卵母細(xì)胞中的表達(dá)A：HCN1電流；B：HCN2電流；C：HCN1+HCN2異聚體電流；D：HCN通道的I-V曲線

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