王偉，王玉琢，舒鵬，米志強(qiáng)，安小平，裴廣倩，劉文麗，袁文俊，史套興，童貽剛

1.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230032；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，北京 100071；

3.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750000

人和動物胃腸道內(nèi)存在大量微生物，它們與宿主的生理功能密切相關(guān)，這些微生物群落之間及微生物與動物宿主之間形成了相互依存、相互作用的不可分割的整體。傳統(tǒng)的微生物學(xué)研究方法主要是對微生物進(jìn)行培養(yǎng)和分離。到目前為止，絕大多數(shù)微生物（99%以上）無法依靠培養(yǎng)的方式獲得[1]，這極大地限制了人們對微生物的研究。

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的應(yīng)用[2-3]，宏基因組學(xué)發(fā)展迅速[4]，為我們了解環(huán)境和人體自身微生物種群提供了新的途徑和視野。宏基因組學(xué)與傳統(tǒng)微生物研究方式的最大區(qū)別在于把微生物看成一個(gè)整體，擺脫了對單個(gè)微生物的培養(yǎng)和分離步驟，直接對環(huán)境中所有的微生物進(jìn)行研究，進(jìn)而可以全面地對所有微生物進(jìn)行分析。隨著宏基因組學(xué)的興起和發(fā)展，人們對人體的腸道、口腔、皮膚組織等中的微生物種群進(jìn)行了研究[5]，發(fā)現(xiàn)了多種新的細(xì)菌，了解了這些細(xì)菌和人體健康之間的關(guān)系。

然而，從最初的細(xì)菌核酸提取到后期的數(shù)據(jù)分析，仍然有較多技術(shù)性和科學(xué)性問題制約著宏基因組學(xué)特別是16S核糖體DNA（ribosomal DNA，rDNA）宏基因組學(xué)的發(fā)展。如細(xì)菌核酸的提取[6]、擴(kuò)增高變區(qū)的選擇、通用引物的選擇[7]、測序平臺的選擇以及后期數(shù)據(jù)分析策略的選擇，都會對宏基因組測序的結(jié)果產(chǎn)生影響。對于來自環(huán)境中的復(fù)雜樣本，細(xì)菌核酸提取的效率和質(zhì)量至關(guān)重要，是后續(xù)擴(kuò)增、測序和分析的基礎(chǔ)。目前細(xì)菌核酸提取的方法有很多種，原理和操作步驟各不相同，各有優(yōu)缺點(diǎn)[8-10]。在此，我們采用TRIzol法、試劑盒法，以及在試劑盒法基礎(chǔ)上進(jìn)行5種改進(jìn)，共7種方法對模擬樣本進(jìn)行核酸提取，并特異性地?cái)U(kuò)增16S rDNA的V1～V2高變區(qū)，之后構(gòu)建測序文庫，分析測序結(jié)果中16S rDNA的分布，還原模擬樣本中各種細(xì)菌的含量和相對分布，尋找一種廣譜、高效的細(xì)菌核酸提取方法。

1 材料和方法

1.1 材料

選取10種在微生物學(xué)與分子生物學(xué)特征上具有顯著差異的細(xì)菌，包括革蘭陽性和陰性菌，分別是金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）、肺炎克雷伯菌（Klebsi?ella pneumoniae）、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）、腸道沙門菌（Salmonella enterica）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、摩氏摩根菌（Morganella morga?nii）、海藻希瓦菌（Shewanella algae）、宋內(nèi)志賀菌（Shigella sonei）、粘質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens）。以上菌種均分離自解放軍307醫(yī)院檢驗(yàn)科。

TRIzol（Thermo Fisher Scientific）；Roche High PurePCR TemplatePreparationKitVersion 2.0（Roche）；溶葡萄球菌酶、溶菌酶（Sigma）；DNA Marker（北京全式金公司）；Q5 High-Fidelity 2×Master Mix、Fast DNA Library Prep Set for Ion Torrent（New England Biolabs）；QIAquick Gel Ex?traction Kit（QIGEN）。

PCR 儀（Gene Amp PCR System 9700）；Ion torrent測序儀（Thermo Fisher Scientific）；NanoDrop system；超聲波儀（南京新辰生物公司）。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)

將上述菌株分別接種于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18 h，挑取單克隆菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)后期或穩(wěn)定期后于4℃保存。

1.3 菌種鑒定

分別取以上經(jīng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后的菌液500 μL于1.5 mL離心管中，沸水浴10 min后作為16S rDNA PCR鑒定模板。上游引物為27F（5'-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3'），下游引物為 1492R（5'-TACGACTTAACCCCAATCGC-3'），產(chǎn) 物 1.4kb。PCR 體系：上、下游引物各2 μL，Q5 High-Fidelity 2× Master Mix 25 μL，DNA 模板 2 μL，用無菌ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR條件：預(yù)變性95℃ 5 min；變性95℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 1 min（30個(gè)循環(huán)）；延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3730測序，進(jìn)行菌種鑒定。

1.4 細(xì)菌鋪板計(jì)數(shù)和等比例混合

將菌液稀釋至1/106、1/107、1/108共3個(gè)梯度后進(jìn)行涂布平板計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)菌數(shù)將10種菌等量混合于1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心3 min，棄上清，用PBS洗滌2次后收集細(xì)菌。

1.5 細(xì)菌DNA的提取

1.5.1 TRIzol提 取 向 混 合 細(xì) 菌 中 加 入1 mL TRIzol后用移液器反復(fù)吹打，室溫靜置15 min，加入0.2 mL氯仿充分振蕩混勻，室溫靜置3 min，4℃、10 000 r/min離心10 min，棄上層水相，保留中間相與下層有機(jī)相，向中間相及有機(jī)相加入0.3 mL無水乙醇，上下顛倒混勻，室溫放置30 min，4℃、2000 r/min離心5 min，棄上清，用1 mL 0.1 mol/L檸檬酸鈉溶液（10%乙醇）洗滌沉淀，室溫放置30 min，期間振蕩數(shù)次，4℃、2000 r/min離心5 min，棄上清，用1.5 mL 75%乙醇洗滌DNA沉淀，室溫放置30 min，期間振蕩數(shù)次，4℃、2000 r/min離心5 min，棄上清后充分晾干DNA沉淀，加入50 μL 8 mmol/L NaOH溶液溶解DNA沉淀，-20℃保存。

1.5.2 試劑盒直接提取 按照Roche High Pure PCR Template Preparation Kit Version 2.0 中 Isola?tion of Nucleic Acids form Bacteria方案提取細(xì)菌DNA，于-20℃保存。

1.5.3 溶葡酶處理后試劑盒提取 向混合細(xì)菌中加入溶葡酶（終濃度 1 mg/mL）20 μL，按照 Roche High Pure PCR Template Preparation Kit Version 2.0中Isolation of Nucleic Acids form Bacteria方案提取細(xì)菌DNA，于-20℃保存。

1.5.4 超聲波處理后試劑盒提取 將混合細(xì)菌置于冰水浴中，間歇超聲波處理（超聲2 s，間隙5 s，功率20%，總時(shí) 5 min），按照 Roche High Pure PCR TemplatePreparation KitVersion 2.0 中 Isolation of Nucleic Acids form Bacteria方案提取細(xì)菌DNA，于-20℃保存。

1.5.5 超聲波處理并加溶葡酶處理后試劑盒提取

將混合細(xì)菌置于冰水浴中，間歇超聲波處理（超聲2 s，間隙5 s，功率20%，總時(shí)5 min），加溶葡酶（終濃度 1 mg/mL）20 μL，按照Roche High Pure PCR TemplatePreparation KitVersion 2.0 中 Isolation of Nucleic Acids form Bacteria方案提取細(xì)菌DNA，于-20℃保存。

1.5.6 勻漿處理后試劑盒提取 將混合細(xì)菌勻漿處理（30 Hz，5 min），按照 Roche High Pure PCR TemplatePreparation KitVersion 2.0 中 Isolation of Nucleic Acids form Bacteria方案提取細(xì)菌DNA，于-20℃保存。

1.5.7 勻漿處理并加溶葡酶處理后試劑盒提取 將混合細(xì)菌勻漿處理（30 Hz，5 min），加入溶葡酶（終濃度 1 mg/mL）20 μL，按照Roche High Pure PCR TemplatePreparation KitVersion 2.0 中 Isolation of Nucleic Acids form Bacteria方案提取細(xì)菌DNA，于-20℃保存。

1.6 細(xì)菌基因組DNA分析

提取后的產(chǎn)物用NanoDrop system檢測DNA的濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳分析混合細(xì)菌基因組DNA的完整性。

1.7 擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的V1～V2高變區(qū)

用通用引物[11]擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的V1、V2高變區(qū)，上游引物為27F（5'-AGRGTTYGATYMTGGC TCAG-3'），下游引物為338R（5'-TGCTGCCTCCCG TAGGAGT-3'）。PCR體系：上、下游引物各2 μL，Q5 High-Fidelity 2× Master Mix 25 μL，DNA模板2 μL，用無菌ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR條件：預(yù)變性95℃ 5 min；變性 95℃ 30 s，退火 55℃ 30 s，延伸72℃ 30 s（30個(gè)循環(huán)）；延伸7 min。2%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，用QIAquick Gel Extraction Kit純化。

1.8 測序文庫的構(gòu)建及高通量測序

投入100 ng擴(kuò)增產(chǎn)物，參照Fast DNA Library Prep Set for Ion Torrent說明書，構(gòu)建高通量測序文庫約400 bp，之后進(jìn)行PGM測序。

1.9 生物信息學(xué)分析

用 NGS QC Toolkit v2.3.3（參 數(shù) ：-l 70-s 20-n 8-m 100-c 8）[12]去除低質(zhì)量及低復(fù)雜度序列，依據(jù)樣品前加的標(biāo)簽序列，用python腳本將7種方法的數(shù)據(jù)進(jìn)行分割提取，再用CLC Genomics Workbench v3.6.1（丹麥 CLC Inc，http://www.clcbio.com）將數(shù)據(jù)比對前期細(xì)菌鑒定的16S rDNA全長序列，用MEGA（v.6.0.5）軟件[13]構(gòu)建細(xì)菌16S rDNA進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 混合樣本的細(xì)菌組成

本次實(shí)驗(yàn)共挑選了10種細(xì)菌，這10種菌在微生物學(xué)與分子生物學(xué)特征上具有顯著差異，包括革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。細(xì)菌基因組16S rDNA拷貝數(shù)為 5～14，16S rDNA 鑒定長度為 1439～1470 bp，16S rDNA GC 含 量 為 51.00% ～55.20% ，擴(kuò) 增 的V1～V2高變區(qū)長度為310 bp，V1～V2的GC含量為51.3%～57.6%，通用引物與細(xì)菌16S rDNA的匹配性較好（表1）。

從細(xì)菌16S rDNA進(jìn)化樹（圖1）可以看出10種菌的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，差異較為明顯，有利于后續(xù)測序數(shù)據(jù)不同細(xì)菌的分類。

2.2 不同方法提取的細(xì)菌DNA含量與純度分析

用不同提取方法得到的細(xì)菌DNA含量與純度不同（表2），TRIzol法提取的細(xì)菌DNA含量最高，勻漿處理后試劑盒提取的細(xì)菌DNA含量次之；超聲波處理后試劑盒提取和勻漿加溶葡酶處理后試劑盒提取的細(xì)菌DNA純度最高，超聲波加溶葡酶后試劑盒提取的次之。

圖1 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)菌16S rDNA進(jìn)化樹

2.3 不同方法提取的細(xì)菌DNA完整性分析

2%瓊脂糖凝膠電泳分析表明，試劑盒提取及超聲波結(jié)合試劑盒提取的模擬樣品細(xì)菌DNA具有較好的完整性（圖2）；TRIzol提取、溶葡酶加試劑盒提取、超聲波加溶葡酶加試劑盒提取、勻漿加試劑盒提取及勻漿加溶葡酶加試劑盒提取的模擬樣品細(xì)菌DNA分子出現(xiàn)了顯著的彌散，表明DNA分子產(chǎn)生了斷裂，完整性差。

2.4 不同方法的高通量測序結(jié)果分析

盡管7種方法中10種細(xì)菌是等比例等量投入的，但測序結(jié)果差別很大（表3），在TRIzol法和超聲波加試劑盒法數(shù)據(jù)中，前三位細(xì)菌相同，分別為蠟樣芽孢桿菌、肺炎克雷伯菌和弗氏檸檬酸桿菌；在TRIzol法、試劑盒法、超聲波加試劑盒法和勻漿加試劑盒法數(shù)據(jù)中，含量最低的3種菌為海藻希瓦菌、奇異變形桿菌和金黃色葡萄球菌；而在溶葡酶加試劑盒法、超聲波加溶葡酶加試劑盒、勻漿加溶葡酶加試劑盒法中，含量最低的2種菌也是海藻希瓦菌和奇異變形桿菌。在溶葡酶加試劑盒法、超聲波加溶葡酶加試劑盒法、勻漿加溶葡酶加試劑盒法數(shù)據(jù)中，金黃色葡萄球菌的數(shù)據(jù)量明顯高于其他4種提取法。蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和奇異變形桿菌基因組16S rDNA拷貝數(shù)分別為14、5、5，在TRIzol法、超聲波加試劑盒法、勻漿加試劑盒法數(shù)據(jù)中，蠟樣芽孢桿菌數(shù)據(jù)比重要高于金黃色葡萄球菌和奇異變形桿菌，表明細(xì)菌16S rDNA拷貝數(shù)對于宏基因組檢測有影響。弗氏檸檬酸桿菌和腸道沙門菌基因組16S rDNA拷貝數(shù)都為9次，通用引物27F與弗氏檸檬酸桿菌和腸道沙門菌的匹配性分別為20/0、16/4，在勻漿加溶葡酶加試劑盒法數(shù)據(jù)中，弗氏檸檬酸桿菌的數(shù)據(jù)比重高于腸道沙門菌，表明通用引物與細(xì)菌16S rDNA匹配性對于宏基因組檢測有影響。

表2 不同提取方法所得細(xì)菌DNA含量和純度測定結(jié)果

圖2 不同提取方法和前處理方法提取細(xì)菌DNA電泳分析1：TRIzol提取產(chǎn)物；2：試劑盒提取產(chǎn)物；3：溶葡酶加試劑盒提取產(chǎn)物；4：超聲波加試劑盒提取產(chǎn)物；5：超聲波加溶葡酶加試劑盒提取產(chǎn)物；6：勻漿加試劑盒提取產(chǎn)物；7：勻漿加溶葡酶加試劑盒提取產(chǎn)物；W：水；M：DNA marker

對7組數(shù)據(jù)中10種菌的相對分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和計(jì)算，繪制柱形圖（圖3），可以直觀地觀察到超聲波加試劑盒提取方法中各種菌的數(shù)據(jù)分布相對均勻。

圖3 不同方法中各種細(xì)菌數(shù)據(jù)量的相對分布

表3 不同方法測序結(jié)果中比對上不同細(xì)菌的序列條數(shù)分布

3 討論

目前，基于16S rDNA測序的宏基因組學(xué)發(fā)展迅速。盡管此技術(shù)在探索各種環(huán)境樣本中細(xì)菌物種的多樣性方面具有無可比擬的優(yōu)勢，但也存在技術(shù)上的不足和缺陷，如在樣本的收集和保存、核酸的提取、擴(kuò)增使用的引物、測序平臺的選擇等方面的不足，進(jìn)而直接導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能真實(shí)地反映細(xì)菌物種的多樣性。本次實(shí)驗(yàn)在排除其他影響因素的情況下，探究了細(xì)菌DNA提取方法對于16S rDNA測序的影響。結(jié)果表明，不同的前處理及提取方法對于細(xì)菌DNA的提取影響顯著，在同一方法中，不同細(xì)菌的提取效果差別很大，對同一種細(xì)菌使用不同方法提取的效果差別也很大。在加入溶葡酶的3種方法中，金黃色葡萄球菌的數(shù)據(jù)量遠(yuǎn)高于另外4種不加溶葡酶的方法，說明溶葡酶處理對于樣本中金黃色葡萄球菌的檢測至關(guān)重要。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)菌16S rDNA拷貝數(shù)及通用引物與細(xì)菌16S rDNA的匹配性對于宏基因組檢測也有影響。在超聲波加試劑盒提取測序數(shù)據(jù)中，各種細(xì)菌的數(shù)據(jù)量分布相對均勻，表明對各種細(xì)菌的提取效果較好，亦即超聲波處理能夠改善試劑盒的提取效果。在其他幾種提取方法中，各種細(xì)菌的數(shù)據(jù)量差別很大，無明顯的規(guī)律可循。

對于來自環(huán)境中的真實(shí)樣本，其復(fù)雜度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本實(shí)驗(yàn)所用的模擬樣本。真實(shí)樣本往往含有更多種類的細(xì)菌、不同的化學(xué)組分，以及來自其他有機(jī)體的細(xì)胞和DNA成分，在宏基因組學(xué)研究中應(yīng)當(dāng)考慮到這些因素。此次實(shí)驗(yàn)探索尋找廣譜高效的細(xì)菌DNA提取方法，提高了宏基因組學(xué)測序技術(shù)反映真實(shí)環(huán)境樣品中物種多樣性的能力。

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