夏燕平,馬騰,齊向云,李慶軍 ,王升啟 ,楊靜
1.河南中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,鄭州 河南 450008;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京 100850;
3.航天中心醫(yī)院 心臟病診療科,北京 100049
腸道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)為單股正鏈RNA病毒,是小RNA病毒科腸道病毒屬A組腸道病毒,也是引起手足口病的主要病原體。與其他引起手足口病的腸道病毒不同之處在于EV71具神經(jīng)嗜性,可引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和神經(jīng)源性肺水腫等疾病[1]。目前,人類是EV71惟一已知的自然宿主[2],5歲以下嬰幼兒為易感人群[3]。該病毒自1969年首次被報道以來,已經(jīng)引發(fā)全球范圍內(nèi)10多次暴發(fā)與流行,給人類特別是嬰幼兒健康造成了巨大的威脅[4]。中藥卷柏為卷柏科植物卷柏(Selagi?nella tamariscina)或墊狀卷柏的干燥全草,其性辛味平,具有活血通經(jīng)、化瘀止血之功效[5]?,F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)卷柏具有抗腫瘤[6~8]、抗病毒[9-10]、抗炎抑菌[11-13]、抗過敏[14]、降血糖[15]、抗氧化[16]和抗衰老[17]等諸多藥理活性。文獻報道卷柏抗病毒的有效成分主要為黃酮類[9-10],而本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)卷柏多糖有很好的抗EV71導(dǎo)致的RD細胞病變效應(yīng),其中30%和50%醇沉卷柏多糖抑制作用顯著,80%和95%醇沉卷柏多糖抑制作用不明顯[18]。目前臨床上尚無特效的抗EV71藥物,主要采用對癥治療和利巴韋林等廣譜類抗病藥物。我們以利巴韋林為陽性對照[19],通過噬斑法和細胞病變效應(yīng)法(cytopathic effect,CPE)檢測了醇沉卷柏多糖在Vero細胞中的體外抗EV71活性,篩選出選擇指數(shù)(selection index,SI)最高的卷柏多糖醇沉部位,并初步探索其對EV71的直接殺滅作用及對病毒生活周期的影響,研究卷柏多糖抗病毒活性的作用機制。
非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)由中國藥品與生物制品研究所贈送,用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的MEM培養(yǎng)液,在37℃和5%CO2條件下培養(yǎng),2 d傳代1次;EV71為國際標準BrCr株,由本實驗室于-70℃保存。
新鮮卷柏采自河南省西峽縣,制備方法參照文獻[18]:用10倍量水煮沸2 h,過濾;濾渣用8倍量水煮沸2 h,過濾;合并2次濾液,減壓濃縮至相對密度約1.1左右得總部位稠膏;用適量水溶解,依次用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,剩余部分低溫減壓濃縮,真空干燥得到水部位干燥物;取適量水部位干燥物水溶后用80%乙醇醇沉2次,過濾,沉淀先后用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌,60℃真空干燥,得棕色卷柏多糖;多糖用適量水加熱溶解后,分別用30%、50%乙醇分級醇沉,得到30%、50%醇沉多糖。使用時用MEM培養(yǎng)液配制成10 g/L母液過濾除去濾渣,0.2 μm微孔濾膜過濾除菌,置4℃?zhèn)溆谩?/p>
利巴韋林注射液(ribavirin,RBW)(國藥準字H19993467,批號12121312)為國藥集團榮生制藥有限公司產(chǎn)品;羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液(HEPES,1 mol/L)、雙抗(青霉素1×104U/mL,鏈霉素1×104μg/mL)和MEM培養(yǎng)液均購自邁晨生物科技公司;胎牛血清(FBS)為蘭州百靈生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;0.25%胰酶-EDTA和MEM干粉為GIBCO公司產(chǎn)品;甲基纖維素(MC)購自Sigma公司;細胞計數(shù)試劑盒(CCK8法)購自DoJoDo公司;病毒RNA提取試劑盒(DP315)和Quant One Step qRT-PCR(Probe)檢測試劑盒(KR113)購自天根生化科技(北京)有限公司;引物和探針序列均由上海生工生物工程股份有限公司合成。
CO2細胞培養(yǎng)孵箱、生物安全柜和超凈工作臺均為Thermo Forma公司產(chǎn)品;mili-Q超純水系統(tǒng)為Millipore公司產(chǎn)品;倒置顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品;低溫高速離心機為Sigma公司產(chǎn)品;酶標儀(Model 680型)和熒光定量PCR儀(CFX96型)為Bio-Rad公司產(chǎn)品;細胞培養(yǎng)瓶為NUNC公司產(chǎn)品;0.22 μm針式滅菌濾器為PALL公司產(chǎn)品。
Vero細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板,待次日細胞生長覆蓋率達70%~80%,將30%和50%醇沉卷柏多糖及RBW在0~4000 mg/L范圍內(nèi)分別用含2%FBS的MEM培養(yǎng)液(維持液)稀釋至所需濃度后加入細胞,并設(shè)空白對照組,每組3個復(fù)孔,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h,鏡下觀察細胞形態(tài)變化,并用CCK8法檢測藥物對Vero細胞的毒性作用。
Vero細胞接種于96孔板,待次日細胞生長覆蓋率達70%~80%,用EV71感染細胞(MOI=1),37℃、5%CO2條件下吸附1 h后吸棄病毒稀釋液,分別加入含不同濃度藥物的維持液,設(shè)空白對照組和病毒感染對照組,每組3個復(fù)孔,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h后收集細胞上清液于-20℃保存,同時用CCK8法檢測細胞活性。
Vero細胞接種于12孔板,待次日細胞生長覆蓋率達100%時,取上一步驟中收集的細胞培養(yǎng)上清液稀釋至1/10后感染細胞(400 μL/孔),37℃、5%CO2條件下吸附1 h后吸棄病毒稀釋液,加入營養(yǎng)覆蓋物(含1%MC、2%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的10 mmol/L的HEPES緩沖液),每日觀察噬斑情況,待噬斑不再增多且直徑較大時用4%甲醛溶液固定,1%結(jié)晶紫溶液染色。2×培養(yǎng)液的配制方法由本實驗室前期實驗摸索得到[19]。按下式計算噬斑數(shù):
用病毒稀釋液直接稀釋50%醇沉卷柏多糖(0、6.25、12.5、25、50和100 mg/L),37℃、5%CO2條件下共同孵育1、3、6 h,用噬斑法測定病毒滴度的變化。
Vero細胞接種于12孔板,待次日細胞生長覆蓋率達70%~80%,用EV71感染細胞(MOI=10),37℃、5%CO2條件下吸附1 h后吸棄病毒稀釋液,換成維持液繼續(xù)培養(yǎng),分別在病毒感染的-1、0、1、3、6和9 h加藥,設(shè)空白對照組和病毒感染對照組,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h,觀察CPE并在鏡下拍照。
參照文獻[21-22]設(shè)計50%醇沉卷柏多糖對病毒吸附環(huán)節(jié)的影響,其作用原理是病毒在4℃時基本上只吸附到細胞上而不穿入細胞內(nèi)部。Vero細胞接種于12孔板,待次日細胞生長覆蓋率達100%時,4℃下放置2 h,病毒稀釋后與不同濃度的藥物預(yù)混,置冰上冷卻后接種細胞(400 μL/孔),置4℃繼續(xù)孵育1 h,用預(yù)冷的 PBS(pH7.3)洗 2 次,加入營養(yǎng)覆蓋物,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),噬斑法測定藥物對病毒滴度的影響。
Vero細胞接種于12孔板,待次日細胞生長覆蓋率達100%時,4℃放置2 h以上,病毒稀釋后(預(yù)先置冰上預(yù)冷)接種細胞,繼續(xù)置4℃孵育1 h,吸棄病毒稀釋液,用pH7.3的PBS洗2次,加入不同濃度的藥物,于37℃、5%CO2條件下分別孵育1 h,用pH11.0的堿性磷酸鹽緩沖液滅活病毒1 min,用pH3.0的酸性磷酸鹽緩沖液中和,棄中和液,用pH7.3的PBS洗1次,加入營養(yǎng)覆蓋物,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),噬斑法測定藥物對病毒滴度的影響[21-22]。
Vero細胞接種于24孔培養(yǎng)板,待次日細胞生長覆蓋率達70%~80%,用EV71感染細胞(MOI=10),37℃、5%CO2條件下吸附1 h后棄病毒稀釋液,加入含不同濃度藥物(0、6.25、12.5、25、50 和 100 mg/L)的維持液,37℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)6、9和12 h后收集培養(yǎng)液和細胞。參照TIANamp Virus RNA Kit試劑盒操作說明書分別提取培養(yǎng)液和細胞中的RNA,用文獻[18]所述引物和探針,按照Quant One Step qRT-PCR(Probe)檢測試劑盒操作說明書進行實驗。反應(yīng)體系為20 μL,反應(yīng)條件為反轉(zhuǎn)錄(50℃)30 min,起始模板變性(92℃)3 min。擴增條件:92℃ 10 s,55℃ 20 s,68℃ 20 s,共40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次,用構(gòu)建的標準品做標準曲線,將得到的各組病毒RNA的拷貝數(shù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。
所有實驗數(shù)據(jù)以x±s表示,用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。各實驗組與對照組樣本均數(shù)采用單因素方差分析,兩兩比較采用q檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
CCK8檢測結(jié)果顯示,在0~2000 mg/L濃度范圍內(nèi),30%和50%醇沉卷柏多糖未顯示出顯著的毒性作用;而RBW在62.5 mg/L濃度時細胞增殖開始受到抑制,隨著濃度的增大,細胞毒性增加(圖1)。計算三者對Vero細胞毒性的CC50(半數(shù)中毒濃度)分別為>4000、>4000和3908.3±8.15 mg/L。
將不同濃度的30%和50%醇沉卷柏多糖及RBW加入EV71感染的Vero細胞中,48 h后檢測藥物對病毒CPE的影響,發(fā)現(xiàn)三者對EV71所致CPE抑制率最高分別可達88%、89%和66%(圖2)。計算三者的IC50(半數(shù)抑制濃度)分別為23.62±2.50、10.43±0.38 和 38.66±4.91 mg/L,SI分別為>169、>384 和101。其中RBW對病毒CPE的抑制作用與文獻[23]結(jié)果一致。
空斑實驗結(jié)果顯示,6.25~100 mg/L的30%和50%醇沉卷柏多糖均能顯著降低培養(yǎng)液中的病毒滴度(P<0.01),并呈現(xiàn)劑量依賴;同等劑量的30%醇沉卷柏多糖抑制病毒滴度效果與RBW相當;同等劑量的50%醇沉卷柏多糖抑制病毒滴度的效果較RBW顯著增高(圖3)。
設(shè)置不同劑量的50%醇沉卷柏多糖與病毒共同孵育1、3、6 h后,噬斑法測定各組的病毒滴度,結(jié)果顯示各組間無統(tǒng)計學(xué)差異(圖4)。
圖1 不同濃度藥物對Vero細胞的毒性
圖2 不同濃度藥物抑制EV71致Vero細胞的CPE作用
在單復(fù)制周期水平上設(shè)計不同時間點加藥實驗,結(jié)果顯示提前1 h(-1 h)至感染后3 h加藥對病毒導(dǎo)致的Vero細胞病變均有抑制作用(圖5)。其中-1 h加藥和感染后0 h加藥(加入病毒的同時加入藥物,吸去病毒的同時吸去藥物)相當,說明50%醇沉卷柏多糖對EV71感染Vero細胞的預(yù)防環(huán)節(jié)不明顯;感染后0和1 h加藥明顯優(yōu)于感染后3 h加藥,說明50%醇沉卷柏多糖對EV71感染Vero細胞的早期環(huán)節(jié)(吸附或穿入)有明顯作用。感染后6和9 h加藥對EV71引起的細胞病變基本無作用,說明50%醇沉卷柏多糖對EV71感染Vero細胞的復(fù)制和釋放環(huán)節(jié)基本無影響。不同時間點加藥實驗只能初步說明藥物對EV71感染Vero細胞生活周期的影響,還須進一步驗證。
圖3 各組培養(yǎng)液上清中的病毒滴度(x±s,n=3)**P<0.01,與病毒感染對照組比較;##P<0.01,與RBW組比較
藥物對病毒吸附影響實驗結(jié)果表明,25、50和100 mg/L劑量的50%醇沉卷柏多糖均能顯著降低病毒滴度(P<0.05)(圖6A);而藥物對病毒進入環(huán)節(jié)影響實驗結(jié)果顯示與病毒感染對照組對比無顯著性差異(圖6B)。
根據(jù)文獻[24]設(shè)計實驗,檢測50%醇沉卷柏多糖是否通過抑制EV71的復(fù)制和釋放環(huán)節(jié)而具有抗病毒活性。結(jié)果顯示,與病毒感染對照組相比,各用藥組細胞內(nèi)和細胞外檢測攻毒后6、9和12 h病毒RNA拷貝數(shù)均無顯著性差異,各用藥組的病毒RNA拷貝數(shù)胞內(nèi)外比值無顯著性差異(圖7),說明50%醇沉卷柏多糖對EV71的復(fù)制和釋放環(huán)節(jié)無明顯作用。
圖4 50%醇沉卷柏多糖與EV71共同孵育后測定的病毒滴度
圖5 50%醇沉卷柏多糖不同時間點加藥對EV71引起Vero細胞病變的抑制作用
本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)30%和50%醇沉卷柏多糖能夠顯著抑制EV71導(dǎo)致的RD細胞病變效應(yīng),本研究證明了30%和50%醇沉卷柏多糖能夠顯著抑制EV71導(dǎo)致的Vero細胞病變效應(yīng)。針對中藥多糖類抗病毒作用機制,已見報道的有抑制病毒吸附[25]和增強宿主機體免疫功能[26]。EV71在活細胞內(nèi)的生活周期約為12 h,其中病毒感染細胞后的前3 h主要是病毒吸附于宿主細胞上并進入細胞,第3~6 h病毒RNA開始大量復(fù)制,感染后第9 h病毒RNA拷貝數(shù)出現(xiàn)最高峰,感染后第12 h病毒顆?;景b完成,進入大量釋放環(huán)節(jié)[20]。病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)值越大,細胞增殖一代的周期相對越短,在較低MOI值的情況下,EV71的增殖動力學(xué)曲線相對較平緩[20]。我們根據(jù)病毒的生活周期設(shè)計實驗,探討卷柏多糖對EV71的直接滅活作用以及對EV71吸附、穿入、復(fù)制和釋放環(huán)節(jié)的作用。結(jié)果表明,50%醇沉卷柏多糖在體外不具有直接滅活病毒的作用;50%醇沉卷柏多糖濃度(>25 mg/mL)與模型組比可顯著抑制EV71感染Vero細胞的吸附環(huán)節(jié),對進入環(huán)節(jié)無影響,對EV71在Vero細胞中的復(fù)制和釋放環(huán)節(jié)無顯著抑制作用。
圖6 50%醇沉卷柏多糖對病毒吸附(A)和進入環(huán)節(jié)(B)的影響(x±s,n=3)*P<0.05,**P<0.01,與病毒感染對照組比較
圖7 50%醇沉卷柏多糖對EV71復(fù)制和釋放作用的影響A:培養(yǎng)液中病毒RNA拷貝數(shù);B:細胞內(nèi)病毒RNA拷貝數(shù);C:培養(yǎng)液中RNA拷貝數(shù)占RNA總拷貝數(shù)的百分比
以上僅對卷柏多糖抗EV71的體外活性及其作用機制做了初步探索,體內(nèi)藥效學(xué)作用研究還未完成。卷柏的有效成分為多糖,如能進一步闡明口服吸收是否會被胃腸道破壞、哪種給藥途徑最佳等問題,將為臨床應(yīng)用該藥或其提取物防治EV71感染性疾病提供實驗依據(jù),也可為抗EV71新藥的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。這也是我們進一步研究的方向。
[1] Chi C Z,Sun Q Y,Wang S,et al.Robust antiviral response stoenterovirus 71 infection in human intestinalepithelial cells[J].Virus Res,2013,176:53-60.
[2] 張燕,朱貞,祝雙利,等.利巴韋林注射液在細胞水平上抑制EV71病毒復(fù)制的初步研究[J].中華實驗和臨床病理學(xué)雜志,2004,23:44-46.
[3] Wang S M,Liu C C.Enterovirus 71:epidemiology,pathogene?sis and management[J].Expert Rev Anti Infect Ther,2009,7(6):735-742.
[4] Solomon T,Lewthwaite P,Perera D,et al.Virology,epidemiolo?gy,pathogenesis,and control of enterovirus 71[J].Lancet Infect Dis,2010,10(11):778-790.
[5]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:210-211.
[6] Le M H,Do T T,Hoang T H,et al.Toxicity and anticancer effects of an extract from Selaginella tamariscina on a mice model[J].Nat Prod Res,2012,26(12):1130-1134.
[7] Lee J S,Lee M S,Oh W K,et al.Fatty acid synthase inhibi?tion by amentoflavone induces apoptosis and antiproliferation in human breast cancer cells[J].Biol Pharm Bull,2009,32(8):1427-1432.
[8] Hsin C H,Wu B C,Chuang C Y,et al.Selaginella tamarisci?naextractsuppressesTPA-induced invasion and metastas?isthrough inhibition of MMP-9 in human nasopharyngeal carci?noma HONE-1 cells[J].BMC Complement Altern Med,2013,13(1):234.
[9] 殷丹,陳科力.江南卷柏提取物的體外抗柯薩奇病毒實驗[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2009,29(4):262-264.
[10]金楠,陳科力,陳剛,等.卷柏屬藥用植物提取物體外抗皰疹病毒1型的研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2009,28(4):415-418.
[11]Pokharel Y R,Yang J W,Kim J Y,et al.Potent inhibition of the inductions of inducible nitric oxide synthase and cyclo?oxygenase-2 by taiwaniaflavone[J].Nitric Oxide,2006,15(3):217-225.
[12]Lee C W,Choi H J,Kim H S,et al.Biflavonoids isolated from Selaginella tamariscina regulate the expression of matrix metalloproteinase in human skin fibroblasts[J].Bioorg Med Chem,2008,16(2):732-738.
[13]Lee J,Choi Y,Woo E R,et al.Isocryptomerin,a novel mem?brane-active antifungal compound from Selaginellatamariscina[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,379(3):676-680.
[14]Dai Y,But P P,Chu L M,et al.Inhibitory effects of Selagi?nella tamariscina on immediate allergic reactions[J].Am J Chin Med,2005,33(6):957-966.
[15]Zheng X K,Zhang L,Wang W W,et al.Anti-diabetic activi?ty and potential mechanism of total flavonoids of Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring in rats induced by high fat diet and low dose STZ[J].J Ethnopharmacol,2011,137(1):662-668.
[16]Zheng X K,Wang W W,Zhang L,et al.Antihyperlipidaemic and antioxidant effect of the total flavonoids in Sela.ginella tamariscina(Beauv.)Spring in diabetic mice[J].J Pharm Phar?macol,2013,65(5):757-766.
[17]王晨靜.新型炔酚類化合物selaginellin抗內(nèi)皮細胞衰老及神經(jīng)生物學(xué)功能研究[D].長沙:中南大學(xué),2010.
[18]韓明明,楊靜,高秀梅,等.卷柏多糖對腸道病毒71型復(fù)制的體外抑制作用[J].國際藥學(xué)研究雜志,2013,40(1):58-62.
[19]艾碧琛.甘露消毒丹及其殘方體外抗EV71及對EV71感染miR-146a、miR-155,TLR4mRNA表達影響的研究[D].長沙:湖南中醫(yī)藥大學(xué),2013.
[20]齊向云,李康,夏燕平,等.腸道病毒71型在RD細胞和Vero細胞中的增殖動力學(xué)特征[J].生物技術(shù)通訊,2014,25(3):333-336.
[21]Chang C W,Leu Y L,Horng J T,et al.Water-soluble ex?tracts act on enterovirus 71 by inhibiting viral entry[J].Virus?es,2012,4:539-556.
[22]李玉環(huán).格爾德霉素的抗病毒作用和抗單純疤疹病毒1型作用機制的研究[D].北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué),1998.
[23]Liu M S,Tao L,Chau S L,et al.Folding fan mode countercurrent chromatography offers fast blind screening for drug dis?covery.Case study:finding anti-enterovirus 71 agents from Anemarrhena asphodeloides[J].JChromatogrA,2014,1368:116-124.
[24]Lu J,He Y Q,Yi L N,et al.Viral kinetics of enterovirus 71 in human habdomyosarcoma cells[J].World J Gastroenterol,2011,17(36):4135-4142.
[25]Chiu Y H,Chan Y L,Li T L,et al.Inhibition of Japanese encephalitis virus infection by the sulfated polysaccharide ex?tracts from Ulva lactuca[J].Mar Biotechnol(NY),2012,14(4):468-478.
[26]Yang T,Jia M,Zhou S,et al.Antivirus and immune enhance?ment activities of sulfated polysaccharide from Angelica sinen?sis[J].Int J Biol Macromol,2012,50(3):768-772.