楊馥語，屈 杰，李 龍，黃彥銘，譚萬初

(成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 610000)

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蒿芩清膽湯對幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS表達影響研究

楊馥語，屈 杰，李 龍，黃彥銘，譚萬初*

(成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 610000)

目的：觀察蒿芩清膽湯對幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜核轉錄因子κB p65(NF-κBp6)、白細胞介素-8(IL-8)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達的影響，探討其治療幽門螺桿菌相關性胃炎(HAG)的作用機制。方法：按照性別、體重隨機抽取10只小鼠作為空白對照組，其余60只小鼠采用幽門螺桿菌(Hp)標準菌株(SS1)布氏肉湯液灌胃造模，建立Hp感染小鼠模型。造模成功后，將其隨機分為6組，每組10只，分別為麗珠胃三聯(lián)組、三九胃泰組、模型組、蒿芩清膽湯高、中、低劑量組，每組小鼠灌服相應藥液，空白組、模型組小鼠灌服等量生理鹽水，每天1次。2周后處死動物，觀察各組小鼠胃黏膜病理改變，采用免疫組化法檢測其胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS表達情況。結果：與模型組比較，蒿芩清膽湯能顯著降低小鼠胃黏膜炎癥面積，降低胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論：蒿芩清膽湯能減輕Hp感染小鼠胃黏膜炎癥，其作用機制可能與抑制NF-κBp6炎癥通路激活，下調IL-8、iNOS過度表達有關。

蒿芩清膽湯；幽門螺旋桿菌；誘導型一氧化氮合酶；白細胞介素8；核轉錄因子

現(xiàn)代研究表明，H.pylori(Hp)感染是慢性胃炎、消化性潰瘍等多種常見胃腸道疾病的首要病因，且幽門螺桿菌相關性胃炎(HAG)是非賁門部胃腺癌的癌前期病變[1]，因此根除H.pylori已成為當前防治慢性胃病的重要方法和研究熱點。Hp的耐藥性以及藥物的副作用等因素嚴重影響了Hp的根除。中醫(yī)藥治療HAG具有癥狀緩解快、副作用小、不易產生耐藥性等優(yōu)勢，具有較高的臨床應用價值。蒿芩清膽湯出自清代名醫(yī)俞根初的《重訂通俗傷寒論》，原方主治少陽濕熱痰濁證，具有清熱利濕、利膽和胃的功效，現(xiàn)代臨床多用于治療功能性消化不良、膽汁反流性胃炎、結石性膽囊炎等消化系統(tǒng)疾病[2]。本實驗通過建立Hp感染小鼠胃黏膜損傷模型，采用免疫組化法檢測胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS的表達情況，探討蒿芩清膽湯治療幽門螺桿菌相關性胃炎的作用機理，現(xiàn)報道如下。

1 材料與試劑

1.1 動物

C57BL/6小鼠70只，SPF級，8～9周齡，平均體重20～25g，雌雄各半，由成都中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，許可證號SCXK(川)2013-24。

1.2 試劑

磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：ZLI-9062)；NF-κBp6試劑(武漢博世德生物工程有限公司，批號：BA0610)；IL-8(北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-0780R)；iNOS抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：ZS-651)；幽門螺桿菌采用SS1(Sydney strain 1)菌株，培養(yǎng)液由四川大學華西醫(yī)學院提供。

1.3 儀器

2015型轉輪式切片機(德國徠卡儀器有限公司)；TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機(常州市中威電子儀器有限公司)；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威醫(yī)療儀器有限公司)；BA200Digital數碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)； Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司)。

1.4 藥物

蒿芩清膽湯(青蒿7g、黃芩10g、法半夏5g、竹茹10g、茯苓10g、陳皮5g、枳殼5g、滑石6g、青黛3g、生甘草1g)由成都中醫(yī)藥大學中藥房提供。中藥浸泡30min后用武火煎煮2次，再將湯汁熬成浸膏，高溫滅菌后備用。麗珠胃三聯(lián)(枸櫞酸鉍鉀片/克拉霉素片/替硝唑片)，由麗珠集團麗珠制藥廠生產。三九胃泰顆粒由三九醫(yī)藥股份有限公司生產。按照實驗動物與人體體表面積比進行等效劑量換算，計算小鼠用藥量。

2 方法

2.1 造模方法

[3]，將SS1凍存菌株經Skirrow’s選擇性及非選擇性培養(yǎng)基復蘇，于37℃微需氧條件下(O25%、CO210%、N285%)培養(yǎng)72h，采用布氏湯收集細菌，并調整濃度為1.0×109CUF/mL備用。小鼠禁食不禁水24h后，除空白組外，其余小鼠均先用5%碳酸氫鈉溶液0.2mL灌胃，30min后按照每次0.2mL/只的劑量，灌胃Hp菌液，連續(xù)4次，每次間隔48h?？瞻讓φ战M小鼠予以等量生理鹽水灌胃。于末次接種后第4周時禁食12h，處死小鼠，取3塊胃竇組織，一塊經石蠟包埋，切片后經W-S染色，進行病理組織學及Hp檢測；一塊進行快速尿素酶試驗；另一塊勻漿稀釋后進行Hp培養(yǎng)，培養(yǎng)后將可疑菌落革蘭染色具有典型特征且觸酶試驗、氧化酶實驗以及尿素酶試驗陽性者判定為Hp感染，其中有兩項陽性者，即說明造模成功。

2.2 分組與給藥

SPF級C57BL/6小鼠70只，平均體重20～25g，按性別、體重隨機取10只為空白組，其余動物接種Hp造模，造模成功后按性別隨機分為A(模型組)、B(蒿芩清膽湯低劑量組4g·kg-1)、C(蒿芩清膽湯中劑量組8g·kg-1)、D(蒿芩清膽湯高劑量組16g·kg-1)、E(麗珠胃三聯(lián)組0.25g·kg-1)、F(三九胃泰組5.2g·kg-1)組，每組10只，雌雄各半，并作標記?？瞻捉M和模型組小鼠以等量生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)2周。實驗過程中密切觀察小鼠一般情況，如毛發(fā)光澤度、體重變化、飲食情況、活動情況、精神狀態(tài)等，并觀察有無死亡情況。

2.3 取材方法

禁食24h后采用頸椎脫臼法處死小鼠并進行解剖，將胃組織沿胃大彎側剪開，采用生理鹽水沖洗后，按組別放入裝有復合固定液的標本瓶中固定，貼標簽保存。分別進行Hp檢測和胃黏膜病理學觀察，采用免疫組化法進行NF-κBp6、IL-8、iNOS檢測，結果采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)進行分析，統(tǒng)計比較每組小鼠陽性表達的平均光密度。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 一般狀態(tài)

空白組小鼠在造模和給藥期間活動正常、反應靈敏、毛發(fā)光澤、飲食可，無死亡小鼠。其他各組中部分小鼠在造模后第2天起可見活動量少、飲食減少、毛發(fā)稀疏、精神萎靡、倦臥，有部分小鼠死亡。

3.2 胃黏膜病理組織學觀察

空白組：黏膜單層柱狀上皮、腺體結構完整，未見明顯炎細胞浸潤。模型組：小鼠胃竇部炎癥程度較重，腺體結構紊亂，可見較多炎性細胞浸潤，以中性粒細胞、淋巴細胞為主。與模型組比較，各治療組小鼠上述病變程度均有所減輕，其中以麗珠胃三聯(lián)組、蒿芩清膽湯高劑量組、三九胃泰組小鼠組織學改善最為明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

3.3 對胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS表達的影響

與模型組比較，三九組、麗珠組、蒿芩清膽湯高劑量組小鼠胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS表達均有所降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但三組間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。蒿芩清膽湯低、中劑量組小鼠胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2、表3、表4。

表1 各組小鼠胃組織慢性炎癥病變程度及積分比較 (±SD)

注：模型組與空白對照組比較，**P<0.01；其余組與模型對照組比較，△△P<0.01。

表2 各組小鼠胃組織 NF-κB p65平均光密度比較 (±SD)

注：模型組與空白對照組相比，**P<0.01；其余組與模型對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

表3 各組小鼠胃組織IL-8平均光密度比較 (±SD)

注：模型組與空白對照組比較，**P<0.01；其余組與模型對照組比較，△P<0.05。

表4 各組小鼠胃組織 iNOS平均光密度比較 (±SD)

注：模型組與空白對照組比較，**P<0.01；其余組與模型對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

4 討論

H.pylori感染所致慢性胃炎屬于中醫(yī)學中“痞滿”“胃脘痛”等范疇，中醫(yī)學認為H.pylori是外感濕熱之邪，慢性胃炎的主要病機為濕熱中阻、氣機不暢、胃失和降，臨床主要表現(xiàn)為口苦、咽干、惡心、干嘔、吐酸、上腹部脹滿不舒或疼痛，其病位主要在胃，但與脾、肝、膽密切相關。目前許多學者認為Hp多為濕熱之邪，HAG患者在證候分布(臟腑氣血津液辨證)上以濕熱中阻(脾胃濕熱)證候為主[4]，故治療應以清熱利濕、利膽和胃為法。蒿芩清膽湯為清熱利濕、利膽和胃的代表方，現(xiàn)代藥理學研究表明[5]，其具有抑制胃酸分泌、促進胃排空，保護胃黏膜和止瀉等作用。臨床研究也亦證實蒿芩清膽湯對濕熱證之慢性胃炎具有顯著的治療效果[6]。

Hp感染人體后定植于胃黏膜，激活轉錄因子NF-κB。NF-κB是炎癥和免疫反應過程中一類重要的轉錄因子，具有廣泛的生物學活性，在黏膜炎癥和修復中具有重要作用，其中P65亞單位在 NF-κB基因轉錄活性中起主要作用[7]?，F(xiàn)代研究表明[8]，Hp感染誘導和激活胃黏膜NF-κBp，促使上皮細胞分泌IL-8等趨化因子，激活iNOS和其他炎癥介質釋放，進而損傷胃黏膜。此外，多種炎性細胞因子以及炎癥介質都受到NF-κB的調控，如TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、集落刺激因子、白三烯等[9]。 已有資料表明[10-13]，Hp感染在誘導胃上皮細胞NF-κB 活化的同時，還可導致IL-8、TNF-α等水平升高；Hp感染誘導胃上皮細胞表達iNOS，這一作用也主要通過NF-κB 激活途徑介導。研究表明[14]，如果抑制NF-κB激活，iNOS的表達將會減少。因此，在治療幽門螺桿菌相關性胃炎時，可通過中藥下調NF-κBp6表達，進而抑制NF-κBp6激活來減輕胃黏膜炎癥程度。

本研究表明，蒿芩清膽湯可顯著降低Hp感染小鼠胃黏膜IL-8、iNOS表達水平，下調NF-κBp6表達，與三九胃泰、麗珠胃三聯(lián)治療效果接近，并對Hp感染所致胃黏膜損傷具有修復作用，其作用機制可能與下調NF-κB P65表達，降低胃黏膜IL-8、iNOS過度表達有關。

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(責任編輯：尹晨茹)

2014-10-10

四川省科技廳科技計劃項目(2013JY0110)

楊馥語(1988-)，女，成都中醫(yī)藥大學碩士研究生，研究方向為中醫(yī)內科脾胃病。

譚萬初(1956-)，成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院教授，碩士生導師，研究方向為中醫(yī)內科脾胃病實驗和臨床。

R285.5

A

1673-2197(2015)04-0016-03

10.11954/ytctyy.201504008