謝 斌，汪德超，陳 喬

(1.江西中醫(yī)藥大學,江西 南昌 330006；2.韶關市中醫(yī)院，廣東 韶關 512000)

?

大承氣湯瀉下作用對內(nèi)毒素血癥大鼠腸道菌的影響

謝 斌1，汪德超2，陳 喬1

(1.江西中醫(yī)藥大學,江西 南昌 330006；2.韶關市中醫(yī)院，廣東 韶關 512000)

目的：探索大承氣湯瀉下作用對內(nèi)毒素血癥大鼠腸道乳酸桿菌和大腸桿菌的影響。方法：將SD大鼠盲腸結扎穿孔造成內(nèi)毒素血癥模型，術后8h分別予以大承氣湯高(5g/kg·q12h)、中(2.5g/kg·q12h)、低(1.25g/kg·q12h)劑量灌胃給藥，每12h 給藥1次，共5次。以實時熒光定量PCR檢測大鼠造模前及造模后8h(給藥前)、2天、7天腸道大腸桿菌及乳酸桿菌數(shù)量。結果：造模后8h，高、中、低劑量大鼠大腸桿菌數(shù)量LOG值增加大于3；造模后2天，高、中劑量大腸桿菌數(shù)量LOG值減少，乳酸桿菌數(shù)量LOG值增加；造模后7天，高、中劑量乳酸桿菌、大腸桿菌數(shù)量LOG值恢復至造模前水平。結論：大承氣湯瀉下作用治療內(nèi)毒素血癥的微生態(tài)機理可能與促進乳酸桿菌增殖并抑制大腸桿菌生長有關。

大承氣湯；內(nèi)毒素血癥；乳酸桿菌；大腸桿菌

內(nèi)毒素血癥(endotoxemia，ETM)屬陽明腑實證，其發(fā)病機理為腸道G-菌過度增殖，內(nèi)毒素入血[1]，中醫(yī)治以通腑瀉熱，方用大承氣湯功效卓越。研究表明，大承氣湯瀉熱通腑能驅(qū)除腸道G-菌并促進內(nèi)毒素排出[2]，然而，現(xiàn)代微生態(tài)學理論認為，治療疾病是使正常有益菌群充分發(fā)揮生物拮抗作用,從而抑制或驅(qū)除致病菌,但該方瀉下作用對ETM腸道有益菌的影響尚不清楚，闡明瀉下對腸道菌的影響對理解大承氣湯治療ETM的作用機制具有重要意義。

本文選取典型有益菌乳酸桿菌及條件致病菌大腸桿菌為代表，以QPCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System)檢測大承氣湯用藥前后ETM大鼠腸道兩種細菌數(shù)量的動態(tài)變化，從微生態(tài)菌群相互拮抗的角度探索大承氣湯治療ETM的通腑瀉熱作用機制。

1 材料

1.1 菌種

乳酸桿菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號CGMCC1.1480，大腸桿菌購自中國醫(yī)學細菌保藏管理中心，編號CMCC44102。

1.2 動物

清潔級SD大鼠，雌雄各半，體重(200±20)g，購自湖南斯萊克曼達實驗動物有限公司，批號：SCXK(湘)2011-0003。

1.3 藥物

大承氣湯：生大黃12g(后下)、芒硝9g(沖)、厚樸15g、枳實12g，購自江西省中醫(yī)院。

1.4 試劑及儀器

EZNA stool DNA Kit，OMEGA，lot：00D40 15010 00H30 L017；QPCR Kit，TaKaRa，lot：BK3305；DU730型核酸蛋白分析儀，美國貝克曼；StepOne Real-Time PCR System,Applied Biosystems。

2 方法

2.1 藥物制備

取枳實飲片12g，厚樸飲片15g，加10倍量水360mL浸泡30min后，沸水煎煮20min，濾液熱浸12g大黃10min后過濾，厚樸和枳實藥渣再加8倍量水300mL左右，沸水煎煮20min，濾液再熱浸大黃10min后過濾，合并兩次大黃濾液，趁熱加入芒硝9g，攪拌使溶解后，低溫濃縮至48mL，以上中藥制成濃度為1g生藥/mL的藥液，置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 造模

采用目前國際公認的盲腸結扎穿孔術(CLP)所致大鼠ETM模型[3]。

2.3 給藥

大承氣湯高、中、低劑量給藥劑量分別為5g/kg·q12h、2.5g/kg·q12h、1.25g/kg·q12h，藥量計算方法參考陳奇主編《中藥藥理學》，計算公式為：B種動物的劑量(mg/kg)=W×A種動物的劑量(mg/kg)，每12h給藥1次，共5次。

2.4 樣本采集

以無菌鑷子采取大鼠造模前、造模后8h(給藥前)、造模后2天、造模后7天時新鮮糞便3粒，貯于無菌1.5mLEP管，記錄時間、組別，并立即于-20℃冰箱保存。

2.5 引物

引用國外文獻設計引物序列：乳酸桿菌(Lactobacillus group，341bp)[4-5]，F(xiàn)：5'-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3'，R：5'-CACCGCTACACATGGAG-3'；大腸桿菌(Escherichia coli subgroup 340bp)[6]，F(xiàn)：5'-GTTAATACCTTTGCTCATTGA-3'，R：5'-ACCAGGGTATCTAAT CCTGTT-3'，英濰捷基(上海)貿(mào)易公司生產(chǎn)。

2.6 標準曲線繪制

大腸桿菌經(jīng)復蘇、傳代3次，采用涂板法計算細菌濃度為5.67×109個/mL。取細菌1mL，細菌基因組提取試劑盒提取DNA，將得到的DNA樣品用無菌TE稀釋至1/10倍，DU730型核酸蛋白分析儀測定A260、A280(DNA質(zhì)量應滿足A260/280≈1.7～1.9)，同時根據(jù)細菌基因組大小計算相應模板數(shù)。將滿足純度質(zhì)量要求的DNA樣品用無菌TE連續(xù)10倍梯度稀釋至10-9，制成系列標準品，將其作為陽性模板進行實時熒光定量PCR反應。

根據(jù)文獻[7]，Ct值(每個反應體系中熒光信號到達設定域值時經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))與該模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)的對數(shù)與Ct值成反比，以陽性模板數(shù)的對數(shù)為橫坐標，以獲取的Ct值為縱坐標即可作出標準曲線。

2.7 糞便細菌DNA提取

按糞便細菌提取試劑盒說明提取細菌DNA。

2.8 QPCR條件優(yōu)化

以樣本細菌DNA為模板，普通PCR擴增，擴增條件為95℃預變性5min；95℃，30s；61℃，30s；72℃，10s；35個循環(huán)后，72℃延伸10min。以1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定PCR產(chǎn)物，與Marker條帶對比，確定DNA片段為目的片段。

2.9 腸道菌DNA的QPCR

按試劑盒說明，采用20μL反應體系、兩步法PCR反應程序，每個樣本重復檢測3次，加入SYBR Premix Ex TapⅡ 10μL，F(xiàn)orward Primer 0.8μL，Reverse Primer 0.8μL，Rox Reference Dye(50×) 0.4μL, DNA模板2μL，ddH2O6μL，擴增條件為95℃預變性30s；95℃，5s；61℃，34s；72℃，1min；35個循環(huán)。反應結束后記錄相應Ct值。

2.10 數(shù)據(jù)處理

3 結果

3.1 大腸桿菌(CMCC44102)標準曲線

大腸桿菌(CMCC44102)DNA經(jīng)QPCR獲取建立標準曲線數(shù)據(jù)，見表1。

表1 大腸桿菌(CMCC44102)標準曲線數(shù)據(jù)

由此數(shù)據(jù)，用Excel作出標準曲線及方程，R2=0.999 1，見圖1。

圖1 大腸桿菌(CMCC44102)DNA經(jīng)QPCR建立的標準曲線

3.2 大鼠腸道菌數(shù)量的常用對數(shù)值

研究結果表明：造模后8h(給藥前)，大腸桿菌數(shù)量增加顯著，乳酸桿菌數(shù)量減少；造模后2d，高、中劑量大鼠腸道內(nèi)過度增殖的大腸桿菌明顯減少，乳酸桿菌數(shù)量迅速增加；造模后7d時，高、中劑量大鼠乳酸桿菌數(shù)量繼續(xù)增殖，而大腸桿菌數(shù)量基本恢復至造模前水平。見表2。

表2 大鼠腸道菌數(shù)量的常用對數(shù)值 (±s)

4 討論

中醫(yī)理論認為，ETM屬外感病極期，其病機為腑實內(nèi)結、熱甚陰竭，為典型的陽明腑實證，而大承氣湯是《傷寒論》治療陽明腑實證的經(jīng)典方劑，臨床用治ETM功效卓著。研究證實，該方具有瀉熱通腑、驅(qū)除腸道G-菌、促進內(nèi)毒素排出的藥理作用[2]，這是本研究選用大承氣湯的理論基礎。

內(nèi)毒素的主要化學成分為脂多糖(lipopolysaccharide/endotoxin,LPS)，是G-菌(如大腸桿菌、傷寒桿菌、結核桿菌、痢疾桿菌)細胞壁的主要成分，而ETM發(fā)病的主要機理是腸道G-菌過度增殖，死亡細菌釋放內(nèi)毒素入血[1]。

乳酸桿菌是典型有益菌，現(xiàn)代微生態(tài)學理論認為，該菌能拮抗條件致病菌的生長，具有維護機體健康和調(diào)節(jié)免疫功能[8]，抑制致病性有害菌和外源性細菌的生長，阻止有害菌入侵，糾正腸道菌群失調(diào)，重建腸道微生態(tài)的作用[9]。

因此，除了瀉下驅(qū)除過度繁殖的G-菌外，促進腸道有益菌增殖，以拮抗G-菌增殖，恢復腸道菌群的平衡是治療ETM的關鍵。故本文擬引入現(xiàn)代微生態(tài)學理論，選取乳酸桿菌及大腸桿菌為代表，從腸道菌的調(diào)節(jié)角度探索大承氣湯瀉下治療ETM的作用機制。然而，腸道微生態(tài)系統(tǒng)大約包含有15 000～36 000個菌種[10]，如何正確估算研究對象的數(shù)量，是本研究所面臨的主要技術難題。

分子生物學的發(fā)展，催生了QPCR技術，該技術具有將極微量基因無限擴增并精確計算原始DNA模板數(shù)量的優(yōu)點，為本課題準確估算腸道兩種細菌數(shù)量提供了有力的技術保障。

研究結果表明，大承氣湯瀉下后腸道菌的動態(tài)變化分為三個階段： 第一階段，大腸桿菌顯著增加，這是大鼠出現(xiàn)ETM的主要原因；乳酸桿菌數(shù)量遠不及大腸桿菌數(shù)量，其原因可能與大腸桿菌過度增殖，拮抗了乳酸桿菌的生長。第二階段，大承氣湯瀉下作用是大腸桿菌減少的主要原因，乳酸桿菌的增殖則基于大承氣湯蕩滌腸道糟粕為其提供了“潔凈”的生長空間，乳酸桿菌為拮抗大腸桿菌的生長而“被動”增殖也可能是其原因之一。第三階段，乳酸桿菌增殖占據(jù)優(yōu)勢，與其具有拮抗條件致病菌對腸道的入侵和定植、維持腸道菌群微生態(tài)平衡的作用有關。

瀉下前后腸道菌的動態(tài)變化表明，大承氣湯治療ETM的作用不僅是瀉下通腑以驅(qū)除G-菌，減少腸道內(nèi)毒素的吸收，同時，其瀉下通腑以蕩滌腸道環(huán)境，客觀上也為有益菌的增殖及拮抗條件致病菌的生長創(chuàng)造了條件，這可能是大承氣湯瀉下治療ETM起效的機制之一。該方對ETM腸道其它菌群有何影響尚有待深入研究。

[1] 楊志寅.診斷學大辭典[M].北京:華夏出版社,2004.

[2] 周鵑,耿耘.大承氣湯防治內(nèi)毒素血癥的研究概況[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(9):2127-2128.

[3] 羅正曜.休克學[M].天津：天津科技出版社,2001:660-665.

[4] WALTER J, HERTEL C, TANNOCK GW, et al. Detection of Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, and Weissella species in human feces by using group-specific PCR primers and denaturing gradient gelelectrophoresis[J].Applied and Environmental Microbiology,2001,67(6):2578-2585.

[5] HEILIG HG, ZOETENDAL EG,VAUGHAN EE,et al. Molecular diversity of Lactobacillus spp．a(chǎn)nd other lactic acid bacteria in the human intestine as determined by specific amplification of 16S ribosomal DNA[J].Applied and Environmental Microbiology,2002,68 (1): 114-123.

[6] MALINEN E，KASSINEN A，RINTTILA T，et al. Comparison of real-time PCR with SYBR Green I or 5'-nuclease assays and dot-blot hybridization with rDNA-targetd oligonucleotide probes in quantification of selected faecal bacterial[J].Microbiology,2003,149(Pt1):269-277.

[7] 趙勝娟.實時熒光定量PCR法檢測雙歧桿菌對小鼠腸道菌群影響的研究[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學,2010.

[8] 金盼盼,鄧燕杰.乳酸桿菌肽聚糖免疫作用的研究進展[J].中國微生態(tài)學雜志, 2013, 25(4):485-487.

[9] NEISH A S. Microbes ingastrointestinal heal and disease [J].Gastroenerology,2009,136(1):65-80.

[10] SARTOR RB. Microbial influences in inflammatory bowel diseases[J]. Gastroenerology,2008,134(2):577-594.

(責任編輯：魏 曉)

Research on Intestinal Bacterias in Rats with Endotoxemia of Dachengqi Decoction

Xie Bin1,Wang Dechao2,Chen Qiao1

(1.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330006,China; 2.Shaoguan Hospital of T.C.M, Shaoguan 512000,China)

Objective:To explore the effect of Dachengqi Decoction urgent purgation on endotoxemia rat intestinal Lactobacillus and Escherichia coli. Methods:Rats with cecal ligation and perforation caused by endotoxemia model, 8h after operation respectively Dachengqi Decoctionhigh (5g/kg·q12h), medium(2.5g/kg·q12h), low (1.25g/kg·q12h) dose, 1 times/q12h,a total of 5 times. Rats by real-time fluorescence quantitative PCR detection before modeling and after modeling 8h (before drug), number of 2d, 7d in Escherichia coli and lactobacillus. Results:After modeling 8h, high, low dose in rats, the number of Escherichia coli LOG was increased more than 3；2d after model establishment, high, middle dose quantity of Escherichia coli LOG value decreased, the amount of Lactobacillus LOG value increased; 7d after model establishment, high, middle dose of Lactobacillus, Escherichia coli LOG value.Return to the level before molding. Conclusion:The micro ecological mechanism of Dachengqi Decoction took effect of treating endotoxemia might promote theproliferation and inhibit the growth of Lactobacillus on Escherichia coli.

Dachengqi Decoction；Endotoxemia；Lactobacillus；Escherichia coli

2014-09-24

江西省教育廳科技項目(GJJ12526)；江西中醫(yī)藥大學校級課題(2012ZR045)

謝斌(1975-)，男，博士，江西中醫(yī)藥大學副教授，研究方向為中藥抗感染研究。

R285.5

A

1673-2197(2015)04-0010-03

10.11954/ytctyy.201504006